甲型HINl流行性感冒病毒血凝素HAl氨基端的表达及双抗体夹心ELISA法的建立.pdfVIP

· 836· 匿堂盘盍 生 !旦箜 鲞箜!塑 inJPreyMed，Septenaber2011v0l_45．N0．9 。 ． 检 验 技 术 ． 甲型 H1N1流行性感 冒病毒血凝素 HA1氨基端 的表达及 双抗体夹心 ELISA法的建立 秦利 胡健萍 杨宇 王林林 王静 甲型 H1N1流行性感冒(简称流感)病毒是一种人类最 蛋白抗体为上海欣百诺生物科技有限公司Sinobio试剂，抗 常见的流感病毒之一，2009年引起流感大流行的病毒并非 组氨酸的鼠单克隆抗体购 自美国 Novagen公司，HisTrapHP 一 种全新的流感病毒 ，陆一涵等 推测可能是北美地区 亲和柱、rProteinAFF亲和柱均购 自美国Ame~ham公司。 的H1N1病毒发生了一定程度的变异 (包括重组和重排)所 3．主要仪器：美国BioRad680型酶标仪 ；UV-7504单光 致。基因组测序发现，该病毒包含禽流感、猪流感和人流感 束紫外可见分光光度计；KS-250超声波细胞粉碎机 (宁波科 3种流感病毒的基因片段 3【4。，其中血凝素(HA)蛋白来源于 生仪器厂)；美 国NanoDropND一1000超微量分光光度计； 猪谱系，一直存在于经典猪流感病毒和三源重排子猪流感病 96孔酶标板为美国Costar公司产品。 毒中 。HA蛋白是流感病毒最主要的表面抗原，与病毒吸 二 、试验步骤 附穿膜及宿主对病毒易感性有关 引，其变异率较高，常通过 1．引物设计：根 据 TopoCloning试剂 盒说 明书，设计 突变使病毒逃脱宿主免疫引起新的流感大流行。这种变异 1对扩增 甲型 HlN1流感病毒血凝素 HA1氨基端的特异性 主要体现在 HA1氨基端球形头部的受体结合部位与抗原决 引物 ，引物前端附加 CACC4个碱基，使其能被 TOPIO感受 定簇氨基酸的改变，因此 甲型 H1N1病毒 HA1氨基端蛋白 态细胞中的拓扑异构酶识别 、切割与连接，提高重组效率。 的表达是建立特异性检测方法的关键。笔者通过原核表达 引物 序 歹U为 ：HA—F：5一CACCATGTATCATGcGAACAATTC 此次甲型 H1Nl流感病毒血凝素HA1氨基端蛋白，制备多 AACAGACACT一3 ；HA—R： 5-TIATCCGGCTIGAACTYCTIG 抗血清，建立了特异性双抗体夹心ELISA检测法。 CTGTATCTY一3 。 一 、 材料与方法 2．病毒 RNA的提取 、扩增及克隆：参照试剂盒说明书， 1．病毒毒种：2009年甲型HlNl流感病毒疫苗株由长春 采用TrizolRNA试剂盒提取 2009年 甲型 HlNl流感病毒疫 生物制药研究所提供 ，用于测试方法的灵敏度 ；季节性流感 苗株的总 RNA，AMV酶反转录试剂盒随机引物反转录后 ，以 病毒株：A／天津津南／15／2009(H1N1)、A／福建 同~．／196／ cDNA为模板进行 PCR扩增，反应条件为 ：94℃预变性 2009(H3N2)、B／江西修7~32／2009(Victoria)、B／广东新兴／ 3min，接着 35个循环，每个循环 94℃变性 30s，52oC退火 134／2009(Yamaga~)等 由北京市 CDC提供，用于测试方法 30S，72℃聚合40S，最后72℃延伸 10min。PCR产物用 的特异性；12份 甲型H1Nl流感患者咽拭子样品和 10份健 1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并进行胶回收，将纯化