灵芝原生质体电融合选育高产多糖菌株的研究.pdfVIP

江苏农业科学 2008年第6期 灵芝原生质体电融合选育高产多糖菌株的研究 高明侠，苗敬芝，曹泽虹，董玉玮，吕兆启 (徐州工程学院生物工程!学院，江苏徐州 221008) 摘要：采用灵芝原生质体电融合技术选育高产多糖菌株 ，通过 电融合方法对紫芝 (Ganodermasinese)和赤芝(Ganodermal~Mnm) 原生质体电融合条件进行了研究，表明灵芝原生质体电融合的最佳条件为：脉冲强度 10kV，脉冲间隙24 s，脉冲次数3次／s，最高融 合率为0．038％。10L罐发酵结果，选育的融合菌株GL一18的生物量和多糖含量分别为 17．52g／L和1．88g／L，均高于亲本菌株。 关键词 ：灵芝；原生质体；电融合 ；选育；多糖 中图分类号：$567．310．3 文献标志码 ：A 文章编号：1002—1302(2008)06—0089—03 灵芝(Ganoderma)是我国医学宝库中的一味珍贵中药， 养基参照文献 [7]配制。(2)完全培养基：土豆 100g(煮汁)， 对高血脂症 、冠心病、心绞痛 、心律失常、克山病、肝炎、出血 酵母粉 3g，蛋白胨5g，葡萄糖20g，KH：P042g，MgSO2g， 热、消化不 良和气管炎等病症均有不同的疗效…。灵芝多糖 维生素B．10mg，琼脂 18g，加水至 1000ml。(3)再生培养 是灵芝的主要活性物质成分，其含量是衡量灵芝品质的重要 基：完全培养基中加入0．5mol／L甘露醇作为稳定剂。 指标之一。紫芝 (Ganodermasinese)多糖含量低 ，但生长速度 1．1．3 试剂 溶壁酶(1ysingenzyme)购 自Sigma公司；纤维 快，产量高；赤芝 (GanodermalucMum)多糖含量高，但生长较 素酶(cellulase)、蜗牛酶 (helliease)购 自上海伯奥生物技术 慢 ，产量低。鉴于 目前利用原生质体融合技术在菌种选育中 有限公司。酶溶液经0．22 m滤膜抽滤除菌，试验中所用的 已有较多成功的例子，该项技术在灵芝菌原生质体制备、分 所有溶液均参照张吉福等 的方法配制。 离、再生和诱变等方面的应用已有不少报道 ，但对灵芝原 1．1．4 仪器设备 CRY一3型细胞融合仪 (宁波新芝科技股 生质体电融合的报道不多 。本试验采用原生质体电融合 份有限公司)，YJ型超净工作台(苏州市苏净集团安泰公 技术，选育高产多糖灵芝菌株，通过 DNA含量测定，Dot— 司)，LGJ型冷冻干燥机 (北京四环科学仪器厂)，GL一20B型 ELISA法和灵芝栽培法鉴定融合子，再利用深层发酵确定菌 离心机 (上海安亭科学仪器厂)，XD一101型倒置显微镜 (江 株高产多糖的性能，并对其遗传稳定性进行研究，为今后对灵 南光电股份有限公司)，MYG—II型回转式恒温摇瓶柜 (上海 芝菌株选育提供理论依据和技术支撑。 欣蕊 自动化设备有限公司)，GBJS一10A型机械搅拌发酵罐 (镇江东方生物工程设备技术公司)。 1 材料与方法 1．2 试验 方法 1．1 材料与设备 1．2．1 原生质体制备 参照 Hamlyn等 的方法进行，灵芝 1．1．1 菌种 紫芝，由上海市农业科学院食用菌研究所提 菌种活化 1—2代，挑选菌丝体片转接至种子培养基中捣碎， 供。赤芝，由中国科学院微生物研究所菌种中心提供。 在27℃、120r／min下振荡培养。当菌丝体生长至对数期时 1．1．2 培养基 (1)PDA斜面培养基、种子培养基和发酵培 取摇瓶培养物，用 100目铜网收集菌丝体 ，无菌水冲洗。再用 0．1moL／LTris缓冲液