葛根素抑制结肠癌HT-29细胞生长及部分机制.pdfVIP

山东医药2008年第48卷第45期 葛根素抑制结肠癌 HT．29细胞生长 及部分机制 方海明 ，梅 俏。，金 娟 ，许建明h (1安徽医科大学第一附属医院，安徽合肥230032；2安徽医科大学) [摘要] 分别采用MTI法、TUNEL法及免疫细胞化学方法，观察葛根素对HT-29细胞增殖的量效和时效关 系、增殖与细胞凋亡的影响及细胞核因子一KB(NF—KB)p65蛋白表达的影响。发现随着葛根素作用时间和剂量的增 加 ，药物对HT-29细胞的抑制率逐渐增高。TUNEL法和免疫细胞化学染色显示，不同剂量组葛根素可使 HT-29细 胞凋亡明显增加，PCNA表达显著降低，同时细胞内NF—KBp65蛋白表达显著降低(P0．05)。认为葛根素具有抗 HT-29细胞增殖作用，可能与阻断NF—KBp65蛋白通路，抑制氧化损伤有关。 [关键词] 结肠肿瘤；葛根素；增殖细胞核抗原；凋亡 [中图分类号] R735．3 [文献标识码] B [文章编号] 1002—266X(2008)45-0066-03 葛根素是从野葛干燥根中提取的一种化学成 对照组，每组设 5个复孔。 分，是葛根总异黄酮主要成分之一，具有抗心血管疾 1．2．2．1 量效关系观察 取对数生长期的HT．29 病、抗氧化、抗肿瘤、抗炎等药理作用。2007年 3月 细胞，以1×10／ml细胞浓度接种于 96孑L培养板， ～ 2008年 1月，我们观察了葛根素对结肠癌细胞株 每组设5个复孔，200 l／，孔，37oC、5％CO：培养箱 HT-29的作用机制，旨在探讨葛根素对 HT一29细胞 中培养24h后弃上清液，实验药物组与阳性对照药 增殖与细胞凋亡的影响，为阐明葛根素抗结肠癌的 组每孔分别加入不同剂量的葛根素及 5一氨基水杨 作用机制提供实验依据。 (终浓度为 l2．5、25、50、125、250Ixmol／L)，模型对 1 材料与方法 照组加等剂量不含药物培养液，继续培养48h，弃上 1．1 材料 葛根素、噻唑蓝(Mr丌)为Sigma公司产 清，加入5 LMrIT溶液 (5mg／m1)20 l，孵育4h 品，RPMI1640培养基为Gibco公司产品，胎牛血清 后，弃上清，加入 0．04mmol／L盐酸异丙醇 120 l／ 由杭州四季青生物公司提供，异丙醇为蚌埠化学试 孔，微振荡 10rain，酶标仪测490nm处光吸收值 (A 剂厂产品，实验前用 RPMI1640培养基配置成所需 值)，计算细胞抑制率，细胞抑制率 =(1一给药组A 浓度 ，微孑L滤膜 (0．22txm)除菌。人结肠癌细胞株 值 ／对照组A值)×100％。 HT-29细胞购于中国科学院上海细胞生物所 。细胞 1．2．2．2 时效关系观察 取对数生长期的HT一29 凋亡检测试剂盒(TUNEL法)购 自南京凯基公司，鼠 细胞，以5×10／ml细胞浓度接种于 96孔培养板， 抗人 PCNA多克隆抗体、兔抗 鼠细胞核因子一KB 同前实验条件培养 24h，实验药物组每孑L加入葛根 (NF—KB)多克隆抗体购 自SantaCruzBiotechnology 素(终浓度为 125I~mol／L)，对照组分别加入等剂量 公司，sP免疫组化试剂盒均购 自福州迈新公司。 5．氨基水杨或不含药物培养液，分别培养 0、12、24、 1．2 方法 48、72、96h。实验结束前4h，弃上清，加入 5 L 1．2．1 HT-29细胞培养 HT-29以RPMI1460为 M1rr溶液(5ms／m1)20 ，孵育4h后，弃上清，加 培养液，加人 100ml／L热灭活的胎牛血