人VEGF在NIH3T3细胞中的基因转移和表达.pdfVIP

2008年 12月 首 都 医 科 大 学 学 报 Dec．20o8 第29卷 第6期 J0umal0fCapita1MedicalUniVersity Vo1．29 No．6 · 基 础 研 究 · 人VEGF在NIH3T3细胞中的基因转移和表达 王雅梅 李慎涛 ， 温铭杰 孙丽翠 司 杨 闫豫东 祁雅慧 (1．首都医科大学基础医学院生化与分子生物学系；2．首都医科大学医学实验测试中心； 3．首都医科大学基础医学院免疫学系) 【摘要】 目的 研究人血管内皮细胞生长因子(humanVEGF)在体外培养的小鼠成纤维细胞(NIH3，乃细胞)中的基因转移及表 达，为血管化组织工程、缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法 应用脂质体介导的基因转移技术，将含有人 VEGF 编码序列 的真核表达载体pcDNA／V转染至体外培养的NIH31、3细胞系中。G418筛选出稳定表达重组质粒的细胞克隆，转接于细胞瓶中， 培养72h，同时以G418筛选的pcDNA3．1(+)阳性细胞克隆和未转染的NIH3113细胞为阴性对照，取细胞培养上清及细胞裂解 液样品进行westemblotting检测。用细胞免疫组织化学染色检测人VEGF 基因在 NIH3r乃细胞中的表达情况，不着色者为阴 性，细胞胞质着色呈棕黄 (褐)色者为阳性。结果 westemblotting结果显示在转染pcDNA／V质粒的NIH3T3细胞培养上清中， 可以检测到相对分子质量为220o0的反应条带，与预计的人VEGF165单体蛋白的相对分子质量相符。细胞免疫组织化学染色 检测结果显示，转染pcDNA／V质粒的NIH3 细胞呈阳性。结论 人 VEGFl65能够在NIH3r乃细胞中有效表达，并获得了稳定表 达人VEGF 基因的NIH3，r3细胞株。 【关键词】 血管内皮细胞生长因子；真核表达载体；NIH313细胞系；基因表达 【中图分类号】 Q785 Expressi0n0fHumanVascularEnd0thelialGr0wthFact0rin CulturedNIH3T3CeUs wangYamei，LiShenta0’。，wengMin ie，SunLicui，siYang，YanYud0ng，QiYahui (1．D’。玎ntQ厂曰0ckm ry0， 。czor曰z0g)，，scoof0厂B 胁(如。f5Ic， ，c叩0z朋 0z e ； 2． 如 ZE印e 。 ￡ er，C叩 Z 如 。Z ；3．D印ⅡmemD厂，mm 加 ，sc00Z d0Z＆e s，C印 妣nZ e ) 【ABsrI1RAcT】 Objective T0studyhumanvascularend0the1ial 0 hfalct0r(hVEGF)genetⅢsferaJ1dexpressioninNIH3 6br0blastce1lline，andestablishtheexperimentalf0undation0fan 0genesistissueen nee ngor mizationaJ1dthetreatment0fischernic 出sorders．Methods pcDNA／V eukaryoticexpressionvect0randpcDNA3．1(+)weretraJ1sfectedim0MH313cellsmedjatedbv liposome．Thetransfectedce1lsweregr m inDMEM medjum c0ntainingG418f0r72 hours，aJ1dtheclones0fcelIswereselectedand continuedt0舯 w inG418medium．Thecel1sstaJ)lyexpressinghVEGFWereselectedunderthepressure0fG418．Theselectedcellswere gr0wninDMEM Ⅱledium c0ntainingG418f 72hours，andthen h【esupemataJ1twasc0llected．Theexpre