重组腺病毒Ad-P2G-DCN的构建及在HEK-293细胞中的表达.pdfVIP

广东医学 2012年4月第 33卷第 8期 GuangdongMedicalJournalApr．2012，Vo1．33，No．8 · 1097 · 重组腺病毒 Ad—P2G—DCN的构建及在 HEK一293细胞 中的表达 木 马伟峰 ，胡厚稳 ，杨飞华 ，蔡绍晖。 南方医科大学公共卫生与热带医学学院(广州510515)；温州医学院药学院(浙江温州325035)； 暨南大学 药学院(广州510632) 【摘要】 目的 制备表达基质细胞衍生因子(SDF一1)拮抗剂P2G与饰胶蛋白聚糖(deeorin，DCN)嵌合基因 的重组腺病毒，并检测其在HEK一293细胞中的表达情况。方法 以前期构建的pET一30a／P2G—DCN为模板， PCR扩增 目的基 因P2G—DCN，并克隆到穿梭质粒 pAdTrack—CMV；然后将化学合成的SDF一1信号肽序列插入 P2G—DCN的5端 ，构建为重组穿梭质粒 pAdTrack—CMV／SP—P2G—DCN；经 PmeI酶切线性化，与骨架质粒 pAdEasy一1在大肠杆菌BJ5183中进行 同源重组，筛选重组腺病毒质粒pAd—SP—P2G—DCN。PacI酶切线性化 的pAd—SP—P2G—DCN通过脂质体介导转染人胚肾转化细胞系HEK一293，包装并扩增重组腺病毒Ad—P2G— DCN。荧光计数确定病毒感染滴度，并以Westernblot法检测嵌合蛋 白P2G—DCN在 HEK一293细胞中的表达情 况。结果 构建了携带P2G—DCN基 因的重组腺病毒，该重组腺病毒感染HEK一293细胞后可高效分泌表达重 组嵌合蛋 白P2G—DCN。结论 成功构建了重组腺病毒 Ad—P2G—DCN，为后续系统研究Ad—P2G—DCN在肿 瘤基 因治疗 中的作用奠定了实验基础 。 【关键词l 基质细胞衍生因子；饰胶蛋白聚糖；腺病毒载体 研究发现，基质细胞衍生因子 一1(SDF一1)与其 为本室保存，pET一30a ／P2G—DCN由本课题组前期 特异性受体 CXCR4是促进乳腺癌等恶性肿瘤转移的 构建。ExTaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内 关键因子 ；表皮生长因子受体 (EGFR)在众多肿瘤细胞 切酶NotI、XbaI、KpnI、XhoI、EcoRV(日本 Takara 高水平表达 ，与其配体表皮生长因子 (EGF)、转化生长 公司)，限制性 内切酶PnieI、PacI(美国NEB公司)， 因子 (TGF一0)【等相互作用 ，促进肿瘤生长、浸润 ，而 Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司)，质粒提取试 内源性多肽——饰胶蛋 白聚糖 (decorin，DCN)通过与 剂盒、胶回收试剂盒 (美国Omega公司)，DCN单克隆 EGFR结合抑制肿瘤生长、浸润和转移 。我们前期 抗体 (美国RD公司)，B—actin单克隆抗体、HRP标记 对野生型SDF一1进行遗传改造 ，获得对其具有拮抗效 的羊抗小鼠二抗 (北京中山金桥公司)，DMEM培养基 应的突变体 P2G，并借助抗体铰链区将P2G与DCN连 (美国Gibco公司)，胎牛血清 (杭州四季青公司)。 接，构建了原核表达载体pET一30a ／P2G—DCN，以表 1．2 方法 达具有双重靶效应的重组嵌合蛋白P2G—DCN。但因 1．2．1 穿梭质粒 pAdTrack—CMV／P2G—DCN的构建 包涵体复性问题的困扰 ，利用现有的原核表达体系难 携带 目的基 因P2G—DCN 的原核表达载体 pET一 以获得足量有生物活性的重组嵌合蛋白P2G—DCN， 30a ／P2G—DCN 由本课题组前期构建。根据 P2G— 难以满足药效学、安全性等后续实验研究。鉴于腺病 DCN的核酸序列和穿梭质粒 pAdTrack—CMV的多克 毒载体具有介导基因转移效率高、感染细胞种类广泛、 隆位点，设计扩增P2G—DCN的1对引物，由上海生工 目的基因表达效率高、病毒易于浓缩和贮存等优点， 合成。上游引物为5一TAAGCGGC∈CTAAGGGCGT— 2009年 10月至2011年 8月本研究拟尝试构建携带 CAGCCTGAGCTACAGAT一3，下 游 引 物 为 5 一 P2G—DCN基因的重组腺