抗原直接包被间接ELISA检测甘蔗黄叶病毒.pdfVIP

第 卷 第 期 热 带 作 物 学 报 . 年 月 . 抗原直接包被间接 检测甘蔗黄叶病毒 高三基 , ? ,陈如凯 福建农林大学农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室.福建福州美国农业部南方研究中心荷马甘蔗育种站.路洲荷马摘要 利用正交设计 方法优化甘蔗黄叶病毒抗原直接包被间接 实验条件,统计结果表明, 甘蔗蔗汁和蔗叶 粗提液包被抗原合适体积为 / ,最佳的抗体浓度 ? 多克隆抗体一抗稀 释倍,碱性磷酸酶羊抗兔 二抗 稀释 ~ 倍,最佳反应时间为。应用这一优化体系, 分析甘蔗不同部位的蔗茎和不同叶位的叶片 滴度的差异.结果表明.上部甘蔗蔗茎 病毒含量显 著高于中下部蔗茎组织,最高可见肥厚带叶 叶及其上一叶一 叶 的嫩叶组织 病毒含量显著高于最高 可见肥厚带叶以下第 叶叶 和第 叶 叶 的老叶组织 甘蔗幼嫩组织部位 滴度较高,更适合于病 毒检测 关键词 甘蔗:甘蔗黄叶病毒;酶联免疫吸附试验. . . . . . 中图分类号 . : .甘蔗黄叶病毒 。 引起的甘蔗黄叶病是一种新的全球性病毒病害,起 初称为甘蔗黄叶综合症。该病害在我国的桂、粤、滇、琼、闽等主要种植甘蔗的省 区都有发生。酶 联免疫吸附试验, 是一种常用血清学检测方法.它将酶标记物 同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合.保持了酶催化反应的敏感性和抗原抗体反应 的特异性,因此具有灵敏度高、特异性强、操作简便的优点,已广泛应用于植物病害病原体的检测和鉴 定,如甘蔗的花叶病毒【 、条纹花叶病毒、黄叶病毒 删、斐济病毒㈣和宿根矮化病菌【 等病害病原体的 检测 但是.国内有关甘蔗 病毒抗原直接包被间接 检测? 技术未见报道 为 此,本研究拟以甘蔗蔗汁和甘蔗叶片粗提液中 为抗原.通过优化反应条件。建立检测甘蔗黄叶病 毒的? 方法.以期为甘蔗黄叶病抗病育种和甘蔗引种检疫提供参考 材料与方法 。 供试材料及试剂 选用福建农林大学农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室种质资源圃 福州 中具有甘蔗黄叶病症状的 ?、 ?、 ? 、 ?、 ?、 ? 、 ? 阳性对照等 个品种 系作为实验材料,并以种植在隔离温室中健康组培苗植株作为阴性对照. 和英文缩写 分 别为福建农林大学和闽引甘蔗品种? 抗体一抗 由美国明尼苏达大学 教授惠赠,磷酸 酶标记的羊抗兔抗购自美国 公司,对硝基苯磷酸二钠 和脱脂干奶粉购自武汉博士德 生物工程公司.其他试剂为国产分析纯 基金项同:现代农业产业技术体系建设专项资金项目 .一 ,公益性行业农业科研专项 .一和福建省自然科学 基金项目 . 资助。 第一作者简介:高 基,男,年生,博士,副研究员。研究方向:甘蔗病原分子生物学与基阕工程。 : . 。 通讯作者,陈如凯,教授,博士生导师。研究方向:甘蔗遗传育种、作物生理遗传与分子育种。 收稿日期:? ?修回日期:? ?期 高 基等:抗原直接包被间接 检测甘蔗黄叶病毒 . 甘蔗蔗汁及叶片病毒粗提液的提取 年 月下旬分别用取汁器钻取供试材料植株上 稍部第 节 、中、下基部离地面第 节部蔗 茎蔗汁 . 于 .干净离心管中,每个品系取样 株.立即带回实验室,, 离心后, 吸取上清液于另一干净离心管中保存于一 ℃冰箱中备用。同时分别取植株最高可见肥厚带叶 叶及其 上一叶 一 叶 、下第 叶 叶 和第 叶 叶片,每个品系取样 株 立即包装编号后迅速保存于 一℃冰箱中备用 叶片病毒粗提液的提取参照 等的方、法【 ,具体步骤如下:将叶片剪成 . ~. 碎片,混 匀,取 ~ 碎片用液氮研磨成粉末。待液氮挥发完,称取 . 于 .干净离心管中,然后加入病毒提取缓冲液 . / 磷酸缓冲液,含 % 和 .,. ,混匀,室温静置 , 其间旋涡 ~ 次。 , 离心后,吸取上清液于另一干净离心管中,保存于一 ℃冰箱中备用。 . ? 检测条件的 表 个因素 种水平 优化 选择直接影响 ? 检测的 个因素.即 :抗原 体积: :一抗浓度 稀释倍 数 ; :二抗浓度稀释倍数 ; :显色反应时间。每个因素设 个水平 表,选取 正 交表进行实验 表。选用 ? 阳性对照, 及脱 毒健康植株 阴性对照. 作为 实验材料.包被液为空白对照, 以 /? / ? 作为评价指标。试验 重复 次 . ? 方法 参考 等同和 等【】试验步骤并略作修改 在酶联板上加样 ~ 。用保鲜膜将板包好,于 ℃保温 。以健康植株蔗汁为阴性对照, 以包被缓冲液 ./ 碳酸缓冲液,. 作空白对照。甩掉酶联板孔中的样品液,每孑 加入 含 的磷酸缓冲液 , / 氯化 钠. . / 磷酸二氢钠, ./ 磷酸氢二钠, . % ,. ,室温放置 后甩 去.控于