猴嗜T淋巴细胞白血病检疫技术规范.docVIP

ICS 点击此处添加中国标准文献分类号 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 XX/T XXXXX—XXXX 代替 猴T淋巴细胞白血病检疫技术规范 Quarantine Protocol for Simian T-cell Lymphotropic Leukemia 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 本稿完成日期：2013-4-29 XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准按照GB/T 1.1给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：叶玲玲，杨云庆，艾军，祝贺，周晓黎，董俊，杨建明，尹尚莲本标准规定了猴嗜T淋巴细胞白血病的病毒分离试验、RT-PCR试验、ELISA抗体检测试验的的技术要求。 Simian T-cell lyrnphotropic virus 猴嗜T淋巴细胞白血病病毒 BJAB细胞 人B细胞淋巴瘤细胞株 CPE，Cytopathic effect 细胞病变作用 RT-PCR 反转录聚合酶链式反应 DEPC，diethylpyrocarbonate 焦炭酸二乙酯 Trizol 酚与异硫氰酸胍组成的均相溶液光学显微镜二氧化碳培养箱离心机可调微量移液器研钵、细胞培养瓶、细胞培养板等试剂材料1640培养基中加入10%的胎牛血清维持液为1640培养基中加入2%的胎牛血清。稀释液为。取稀释液, 置乳钵中研磨，3 000rpm离心20min，取上清液，0.45(m滤膜过滤，置-70℃保存备用。组织样品采集与处理：无菌采集动物淋巴结，剪碎后加入稀释液 10mL（含青霉素2 000IU/mL、链霉素2 000μg/mL），置乳钵中研磨，3 000rpm离心20min，取上清液，0.45(m滤膜过滤，置-70℃保存备用。接种敏感细胞处理后的样品按1:10比例接种于37℃ 5% CO2培养箱中培养，24h后逐日观察细胞病变(CPE)，连续观察d-5d。判定盲传2代，无细胞肿大、死亡等病变现象(CPE)出现，判为病毒分离阴性；出现细胞病变，则需进一步进行鉴定。RT-PCR） 设备和器材 高速冷冻离心机、PCR仪、凝胶电泳仪、凝胶成像系统反转录试剂Trizol，AMV-RT（13U/(L），dNTPs（10mmoL/L），RNasin（40U/(L），Taq DNA酶（5U/(L），RT-PCR和PCR缓冲液，DNA分子量标准，随机引物（25mΜ）电泳缓冲液，溴化乙锭溶液，DEPC水，琼脂糖）。阳性对照感染S病毒的细胞培养物。阴性对照正常细胞或未感染动物的红细胞。酶标仪37℃恒温箱可拆96孔酶标板多孔道单孔道可调微量移液器感染细胞pH 9.6的包被液稀释抗原，加入酶标板，每孔100μL4度过夜。洗板 取出酶标板弃去液体，每孔加洗液200 μL，洗板，共三次。最后一次倒置拍干。加样 样品阴性对照用稀释液作1：稀释，混匀，加入ELISA反应板，每孔μL；37℃震荡反应1 h； 每孔加 μL HRP 标记的兔抗猴抗体工作液，混匀。37作用。洗板 按操作。加底物液 每孔加0 μL TMB 底物液，37作用min。终止反应 取出反应板，每孔快速加入0 μL终止液，在30 min内测其。 测吸光值 用酶标仪在450 nm波长下，测定其吸光值。 计算 阳性对照S/N(2.1，阴性对照(2.1时进行判定。被检血清S/N(2.1，判为STLV病毒抗体阳性，S/N(2.1 判为被检血清STLV病毒抗体阴性。  （规范性附录）PCR试验溶液配方 TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液) Tris 54 g H3BO3 27.5 g EDTA 2.922 g 去离子水 1 000 mL。 用5mol/L的盐酸调到pH8.0。使用时用去离子水稀释至0.5倍的TBE电泳缓冲液。 μL。 上样缓冲液 每100 mL水溶液中含：溴酚蓝0.25g，蔗糖40g。 DEPC水 取1 mLDEPC(焦碳酸二乙酯)加入1000 mL去离子水中，37℃过夜，1.01×105Pa高压灭菌30 min。 1.0%琼脂糖凝胶的制备 在200mL三角烧瓶中加入：电泳级琼脂糖，1.0g；0.5×TBE缓冲液，100 mL。微波炉中使之完全溶解后，加入10 mg/mL溴化乙锭溶液5μL充分摇匀，备用；待琼脂糖冷却到60℃左右，倒入制