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线路二：哺乳动物细胞 RNAi 实验：siRNA 的设计，合成 前面说过，哺乳动物细胞导入30bp 以上的长双链RNA （dsRNAs ）往往会诱发非预期的抗病 毒应答反应，所以不能用体外合成长的dsRNA 直接导入细胞。常见的做法之一是直接制备19—27bp 左右的siRNAs ，然后再将siRNAs 转入哺乳动物细胞。 siRNA 的设计是决定RNAi 实验成败关 75% 。siRNA 算是非常高效的，只需很低的浓 键性的第一步。虽然 siRNA 设计法则在不断 度就可沉默基因表达，达到有效浓度后再增加 地完善，可是并非每个设计出来的 siRNA 一 也不会提高基因沉默的效果，反而研究结果表 定能有效沉默目标基因的表达，也没有办法 明过高浓度的 siRNA （超过100nM 以上）还 100％预测设计出来的siRNA 是否有效，所以 有可能导致非预期的脱靶反应。所以在实验 设计出来的 siRNA 都必须经过实验证实。 中，通常就需要摸条件，以有效的最低浓度为 直接购买已经证实有效的 siRNAs，好处 最适浓度以期减少非特异反应。 是已经厂家荧光定量 RT-PCR 预证有效，无 因此在购买现成的 siRNA，同样的包装 需设计、合成和验证，无需顾虑 siRNA 是否 量，有效工作浓度不同，每次使用的成本就不 有效，便于研究人员把全部精力集中到目标基 用，比如 Bio-Rad 的27bp siRNA 保证工作浓 因功能的研究上，而不需要花费在其他地方— 度是 5nM，Ambion 的保证有效的最高工作浓 —在全球科学家争分夺秒抢夺基因功能研究 度是 30nM，多数厂家是 100nM，如果是荧光 成果和专利的今天，时间就是金钱，为什么要 标记的 siRNA 工作浓度通常达到 100nM。假 把宝贵的时间和精力浪费在反复琢磨如何设 设同样的量，就算 Bio-Rad 的27bp siRNA 比 计和验证 siRNA 上呢？除非你立志成为 100nM 工作浓度的其他品牌 siRNA 产品贵上 siRNA 设计专家。 20 倍，二者每次实验使用成本也是一样的！ 专业的设计，高质量的合成和纯化，往往 因此，在考虑价格和包装时也要同时留意其有 只需要很低的浓度就可以达到不错的基因沉 效工作浓度，才好比较价格。当然也需要同时 默效果，也有助于减少脱靶等非预期反应—— 考虑评估标准是用哪种细胞株。以 Qiagen 的 需要特别说明的是大多数 siRNA 不能达到 资料为例，其验证 siRNA 用于 Hela 、A549 100%沉默基因表达的效果毕竟不是基因 细胞工作浓度为 5nM 足够，用于 HepG2 、 彻底敲除，只是在转录后水平降解 mRNA ， HEK293 、MCF-7 细胞则需要用到 25nM 。 再加上siRNA 转染本身很难保证 100%的细胞 被成功转染，未转染细胞在检测时也会影响结 虽然很多厂家如 Qiagen 等都在持续进行 果 以RNAi 试剂领域两大领先厂家Ambion siRNA 验证工作，以满足更多研究人员的需 和 Qiagen 为例，他们把能降低目标基因表达 求，但是毕竟预证有效的 siRNA 还是有限的， 70% 以上的siRNA 称为有效，也有些公司的 如果你的基因并不在此范围内，你也可以选择 标准更高，如 Bio-Rad 标准是减低目标基因 1. 厂家设计定制只要提供基因的信息，即