WesternBlot中的三大常见问题.pdfVIP

Western Blot 中的三大常见问题 Western Blot已经成为实验室中检测蛋白质的常规手段。不过想要得到一张条带清晰、没有杂带、 背景干净的图片，还是具有一定挑战性的。我们在做蛋白电泳和 Western Blot时，多数都用的 Bio-Rad 公司的仪器，所以 Bio-Rad蛋白方面的技术专家的确可以称之为专家，因为每天都有很多人向他们请教。 他们就将最常见的问题整理成《Western Blotting Troubleshooter》。我们节选了一部分，希望能帮 你节省一些查资料的时间。 Q ：我的结果是膜上一片空白。为什么会这 1:1000-1:10000 来稀释腹水或超免疫动物的血清。 样？ Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1:3000。 A ：导致这种结果的因素很多。 酶失活了 叠氮钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。不 要在HRP显色的western blot 中使用任何含叠氮钠 胶和膜放反了 如果在转印的过程中，胶和膜的位 的试剂。叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体 置颠倒了，那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中，而 中，而无副作用。另外，自来水或用聚苯乙烯树脂 不会到达膜上。对于标准的转印，凝胶应靠近三明 去离子的水也可能会使酶失活，只能使用蒸馏的去 治的负极，而膜对应正极。 离子水。 转膜效率低 转膜效率受多种因素影响，包括蛋白 使用Tween-20 洗涤 Tween-20 （吐温-20 ）可能会 的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转 干扰某些抗体-抗体相互作用，或洗走NC膜上的目 印时间和缓冲液的pH值。一般说来，蛋白越大， 的蛋白。尽管在洗涤时它的终浓度只有 转移得越慢。转移大蛋白最好的方法是用高的电场 0.05%-0.1%，但仍可能会影响结合。因此除了封 强度。而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会穿 闭之后的第一次洗涤，其他洗涤过程中都不使用 出转印膜。避免这个问题的方法是用0.2 um孔径 Tween-20，不过，这可能会使背景升高。 的NC膜或PVDF膜进行转印。如果蛋白的等电点接 近缓冲液的pH值，那么这个蛋白携带的电荷很少， 检测系统缺乏足够的灵敏度 确保蛋白的上样量 在电场中也几乎不移动。如果你的目的蛋白是强碱 在检测系统的灵敏度范围内： 性的，那么你可以用碳酸盐（pH9.9 ）、CAPS 辣根过氧化物酶 500 pg/band （pH11）及酸性缓冲液。 碱性磷酸酶 100 pg/band 在转印之后，你可以通过染胶或第二块膜来判 断转印效率。为了帮助你直接监控转印效率， 增强的碱性磷酸酶 5 pg/band Bio-Rad 也提供了多种预染 Marker，它们在电泳 胶体金 100 pg/band 以及转膜之后可直接观察到。