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显微注射用质粒DNA 的制备
用于显微注射的DNA 的纯度对于成功产生转基因小鼠是极其关键的。细菌内毒素或有机
物的污染都可能显著降低转基因DNA 的整合效率和/或显微注射后胚胎的存活率。目前有许多
方法可以制备高纯度的质粒DNA ，为了保证显微注射服务的成功率，我们通常推荐以下方法
制备用于显微注射的质粒DNA 。
推荐的质粒DNA 制备方法：
1）用以下任意一种试剂盒制备质粒DNA ：NucleoBond PC20 Kit (Clontech: Cat# 740571);
Qiagen EndoFree Plasmid Kit (Qiagen: Cat# 12362); 或Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen:
Cat# 12162) 。
2 ）取20 μg 质粒DNA ，通过限制性内切酶将目的片段从质粒载体上分离出来。用含有0.1~0.2
μg/mL 溴化乙锭（EB ）的1×TAE 缓冲液配制0.8% 的琼脂糖凝胶对样品进行电泳。
3 ）用一块干净的刀片在长波紫外光下将片断切割出来（因短波紫外光可能会破坏DNA 因此
不推荐使用）。
4 ）按如下方法纯化DNA 片段：
对于小于10 Kb 的DNA 片段，用Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit (Cat# 28704) 纯化，
并在最后一步用40 μL 质粒注射缓冲液洗脱DNA 。
对于10~40 Kb 的DNA 片段，用Qiagen QIAEX II Gel Extraction Kit (Cat# 20021)纯化，
并在最后一步用40 μL 质粒注射缓冲液洗脱DNA 。
5 ）用分光光度计（如NanoDrop ）测量DNA 浓度。
6 ）在琼脂糖凝胶上检验100 ng DNA，并与已知浓度及大小的等份DNA 标准品（例如Gibco
High DNA Mass Ladder: Cat# 10496-016 ）进行比较。4 ℃保存。
注意：客户需要向我们提供至少50 μL溶解在注射缓冲液中的DNA，并且浓度不低于100
ng/μL，同时需要附上DNA 的凝胶电泳图片。DNA 的运输可在室温下进行。
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缓冲液配方：
1）质粒注射缓冲液含有：
- 7.5 mM Tris
- 0.2 mM EDTA
2 ）40 mL 质粒注射缓冲液的配制方法：
- 1 M Tris-HCL, pH 7.4 （推荐Sigma 产品：Cat# T2663 ）: 300 μL
- 0.5 M EDTA （推荐Sigma 产品：Cat# E7889 ）: 16 μL
- 添加高品质的蒸馏水至40 mL
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