小尾寒羊耳组织成纤维细胞系的建立与生物学特性研究.pdfVIP

维普资讯 512 畜 牧 兽 医 学 报 36卷 物名称、性别、H龄、冻存编号、冻存 日期等。然后． 及其与冻前活率的比较可知，冻存及复苏对细胞的 将冻存管敝人装有异丙醇 的冷冻盒 中．于一7O℃ 活力状况有所影响，但影响不大 冰箱 中过夜 次 日放人液氮罐中分类保存 。 1．5 活率计算 参照文献[6]方法，计数 1000个细胞．计算细 胞存活率r 。 1．6 生长 曲线 将终浓度为 3．24×10／mL的小尾寒羊成纤维 细胞接种到 24孔培养板上，按文献[6]方法求得生 长曲线和倍增时间参数。 1．7 染色体分析 图 l 小尾寒羊原代细胞 【lox3．3I 按照常规方法进行染色体制片，Gimesa染色后 H I Prim arycellsofSmall’FailHart sheep 油镜下观察并拍照 。对 5O个铺展完好的中期相统 计染色体数 目_! 。 1．8 同工酶分析 按照 ATCC的同工酶淀粉凝胶 电泳技术．参考 文献[6]并加以改进．先收集细胞，用PBS清洗，以 5×10VmL重悬，制备酶的粗提液 回收上清液，等 分，贮存于一70℃。准备好垂直平板，电泳缓冲液 为Tr[s一甘氨酸 (pH8，7)，凝胶缓冲液 由不连续系 统组成：浓缩胶由0．0l7mol／LTris一柠檬酸缓冲液 (pH 6．8)制备 ，分离胶由0．078mol／ITris一柠檬酸 国2 小尾寒羊传代细胞 【l0X3．3) 缓冲液 (pH8．9)制备 加样后 ，设置电压在 120V． Fig．2 SuloculturedcellsofSmallTailHartsheep 在原地 电泳 1h．然后蒋电泳槽放进冰箱(4℃)，电 泳 0．5h后．将 电压调整为 220V，电泳 3h。电泳 2．3 生长 的动态观察 结束．将浓缩胶割去．加入不同染色液对苹果酸脱氢 细胞生长曲线均呈 “s”型．经历了潜伏生长期、 酶或乳酸脱氢酶同工酶进行染色，对染色后的结果 指数生长期以及平台期 刚刚接种细胞生长缓慢， 进行拍照 ’…。 这与其适应新的生长环境有关，接种第 2天起细胞 1．9 细菌、真菌、支原体检测 进入指数生长期 ．其倍增时间约为 24h，这是细胞 均参照文献[6]方法进行 生长最快的时期 ．从第 j天起细胞的生长速度逐渐 变缓 ．进入平台生长期，这主要是因为细胞生长可利 2 结果与分析 用的空间逐渐被占据．细胞产生接触抑制和密度抑 2．1 形态学观察 制所致 。小尾寒羊成纤维细胞生长曲线见图3。 组织块贴壁后5～12d．便可见大量细胞从组织 ： 40 块周围生长，成纤维样细胞与上皮样细胞均有，随后 差30 细胞迅速 向外扩散，平均 10d左右可铺满瓶底 。细 三2o 胞经传代之后，成纤维细胞生长逐渐 占优势，经 2～ 3次传代，即可得到纯化的成纤维细胞．细胞呈长条 塞IO 景 0 形或纤维状 。原代细胞及传代后细胞见图 】．2。 时~uJ／d 2．2 冻存前及复苏后细胞活率 细胞 冻存 前 和复 苏后 的平均 活率 分 别 为 图3 小尾寒羊细胞生长 曲线 Hg．3 GrowthcⅡrYeOfSmallq[