小麦泛素融合降解蛋白基因全长cDNA的克隆及分析.pdfVIP

维普资讯 第 22卷 第 5期 石河子大学学报 (自然科学版) V01．22 No．5 2004年 10月 JournalofShiheziUniversity(NaturalScience) Oct．2004 文章编号 ：1007．7383(2004)05—0369—04 小麦泛素融合降解蛋 白基因全长 cDNA的克隆及分析 黄先忠。’，马正强’，魏灵珠’，刘 彤 ，张 强 (1南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 ，江苏 南京 210095； 2石河子大学生物工程学院，新疆 石河子 832003；3石河子大学农学院，新疆 石河子 832003) 摘要 ：实验利用 RT．PCR技术 ，在小麦矮苏3品种中克隆了1个编码泛素融合降解蛋 白基 因的 cDNA，并且含有完整 的5，端 ，将该基因命名为 Tufd1，利用 RACE技术克隆了该 cDNA的 3端。根据这 2段 cDNA克隆，设计特异引物 ，利 用 RT—PCR扩增出了 Tufd1完整的开放读码框 (ORF)，其编码 区长 948bp，编码 315个氨基酸的多肽，在 NCBI中运行 BLAST。分析表 明，Tufd1蛋 白同拟南芥的 UFD1蛋 白有 74％的同源性，在所编码 的多肽链 的 N．端有 UFD1保守结构 域 ．可作为催化蛋 白降解 的信号。 关键词：小麦；泛素融合降解蛋白；克隆；分析 中图分类号 ：s512；Q785 文献标识码 ：A 泛素作为 76个氨基酸的小多肽 ，在真核生物 中 1 材料与方法 广泛存在 ，是一种十分保守 的蛋 白 。 。它参与 了 许多细胞 的基本活动 ，例如细胞分化 、胁迫反应 、调 1．1 材料 节蛋 白稳定水平 、细胞周期 的控制、转录的调节 以及 苏麦 3号近等基 因系矮苏 3，由南京农业大学 细胞 的程序性死亡等 。 作物遗传与种质创新 国家重点实验室提供 。 细胞 中，半衰期短、变性 、异常的蛋 白以及某些 1．2 方法 调节因子和信号转导蛋 白共价的连接 1个或多个泛 1．2．1 总 RNA的提取 素分子 ，形成聚泛素化 的蛋 白，通过泛素蛋 白体通道 矮苏 3的种子置于 10cm的培养皿上发芽。待种 进行选择性降解b 。泛素融合 降解蛋 白(UFD)是 子萌动后置于 4~C的冰箱 中以保证发芽整齐。2d后 依赖泛素 的蛋 白水解通道 中的一种重要 的酶 。最早 置于25℃的光照培养箱 中。幼苗生长 1周后 ，将收获 的研究是在酵母细胞 中进行，后在人类 、果蝇、老 鼠、 的叶片迅速置于液氮 中冷冻 ，一809C保存 。总 RNA 拟南芥和水稻等细胞 中均克隆出编码该类蛋 白的基 的提取采用 GIBCOBRL公司的Tfizol试剂盒提取 。 因 。 1．2．2 RT．PCR 我们进行了小麦矮秆抗穗发芽基因 Rht(reduce 取 2g 叶 片 总 RNA，加 入 1L 1mmol／L height)的克隆实验 ，获得 1个与编码泛素融合 降解 Oligo(dT)12．18，加水至 5ptL，70℃温育 10min，置于冰 蛋白高度 同源 的 EST序列 ，并 以此序列为基础 ，运 上 ，加 入 2ptL5XFirststrandbuffer缓 冲 液、1L 用 RACE技术获得 了该基 因的3端 ，根据这 2个序 10mmol／LdNTPmix、1“L20mmol／LDTY混匀后 42℃ 列设计特异 引物 ，通过 RTPCR得到 了该基 因的完 温育 5min，加入 200USuperse