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金银花主要有效成分绿原酸的快速测定方法 张秋芳，刘波*，史 怀，黄素芳 (福建省农业科学院生物技术研究所，350003) 摘要：目的 建立金银花主要有效成分绿原酸总量的快速比色测定方法。方法 采用酚类物质中酚羟基与三氯化铁的显色反应，对绿原酸与三氯化铁的显色反应的一些特征参数，如：显色反应的条件、显色产物的吸收波长、稳定性、标准工作曲线及回收率等，进行考察与测定。结果 该显色反应物的检测波长为755 nm；以绿原酸的吸光度和浓度得出工作曲线，回归方程为Y（μg/ml）＝231.77 X＋5.4114，相关系数为0.9982；绿原酸的浓度在0～181.0μg/ml范围内符合比耳定律，表观摩尔吸收系数ε＝1.495×103 L·mol-1·cm-1，检出限为3.78 μg/ml、回收率为92.22%。结论 该方法简单、快速、廉价，可望用于中药材金银花质量的快速检测与评价，指导其生产实践。 关键词：金银花；绿原酸；快速测定；显色反应；比色法 中图分类号： 656 文献标识码：A 金银花(Lonicera japonica Thumb)，又称忍冬，是常见中药材之一，具有抗氧化、清除自由基、降血脂、降血压、预防心血管病、抗突变、抑菌解毒、消炎利胆等多种药理活性功能，其主要有效成分为绿原酸(chlorogenic Acid ，CHA)[1-6]。常见的绿原酸含量的测定方法主要有紫外分光光度法（UV）、高效液相色谱（Rh- HPLC）法以及高效毛细管电泳（HPCE）法等[7-9]。但这些方法的成本昂贵，无法普及使用，特别是难以用于农村基层生产及流通过程中急需的中药材质量控制。因此，有必要研究、建立一种既可迅速测定其含量而又廉价的快速检测方法。 与三氯化铁的显色反应，是酚类物质的重要化学特性之一。这种特殊的显色反应，可以用来检验酚羟基的存在[10]。初步研究表明，该反应也可应用于定量分析。本研究拟在此基础上，对绿原酸与三氯化铁的显色反应的一些特征参数，如：显色反应的条件、显色产物的吸收光谱与稳定性、标准工作曲线及回收率等进行考察与测定，为建立金银花中绿原酸总量的快速测定方法提供参考。 1材料与方法 1.1主要仪器和试剂 主要仪器：岛津UV2550型紫外分光光度计，722可见分光光度计，万分之一天平，移液管，粉碎机，80目筛，KQ-250DE型医用数控超声波清洗器（功率100%），一次性医用注射器；主要试剂：绿原酸 (购自Sigma公司，纯度为95％)，显色剂为0.01 M FeCl3甲醇溶液，甲醇（购自Mark公司，色谱纯）。供试金银花购自药店。 1.2实验方法 1.2.1标准溶液的配制 准确称取绿原酸标准品，将原液配制成254μg／ml，并配制出浓度分别为181.0、150.8、120.6、87.6、60.3、30.2、15.1和0 μ2 结果与分析 2.1 显色反应原理 与三氯化铁的特殊显色反应，被认为是检测酚类物质的定性方法，其反应式为6ArOH+FeCl3→[Fe (OAr)6]3- + 6H++3Cl-[10]。绿原酸也是一种酚类物质，其结构如图1所示[11]。初步试验表明，绿原酸与三氯化铁的显色反应产物的吸光度与绿原酸的含量呈良好的线性关系，而反映金银花质量的指标性成份即为绿原酸。因此，该反应可用于金银花中绿原酸含量的测定。 图1绿原酸结构图 2.2 最佳实验条件的选择 鉴于绿原酸是中药材金银花中的主要指标性成分[1,2,4]，因此本研究以绿原酸标准品制作标准工作曲线，显色溶液的吸收光谱扫描、方法建立和评价均在岛津UV2550型紫外分光光度计上完成。 2.2.1 吸收光谱及测定波长 橙黄色的FeCl3溶液可与无色透明的绿原酸甲醇溶液反应，从而生成深绿色络合物质。对上述显色方法中的空白液和试样液进行光谱扫描，结果见图2。由图2可得，该显色反应物可见光范围内的最大吸收峰的波长为755 nm。 图2 显色产物的吸收光谱 注：LU为绿原酸扫描图谱；Fe为氯化铁溶液扫描图谱；LU+Fe反应后扫描图谱。 2.2.2 显色条件的选择 初步试验表明，该显色反应与反应的时间和温度有较大的关系，同时显色剂FeCl3溶液的加入量也显著影响显色反应的进行。因此，在选择、优化显色条件时，本研究采用三因素三水平正交试验方案L9（34）。正交试验的方案设计与结果分析详见表1和表2。 表1 L9(34)正交试验和水平 水平 因 素 A：温度(℃) B：FeCl3(ml) C：反应时间（min） 1 45 0.5 30