检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用.pdfVIP

浙江农业学报ActaAgricuhuraeZhejiangensis22(6)：745～749，2010 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 SYBRGreenI实时荧光定 量 PCR方法的建立及初步应用 杨春华 ，胡 慧 ，钟 毅 ，韩志涛 ，祝建新 (江西出入境检验检疫局 检验检疫综合技术 中心，江西 南 昌330002；河南农业大学 牧N32N学院，河南 郑州 450002) 摘 要：利用反转录PCR (RT—PCR)技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)GP5基因部分片段 ，并克 隆到pGEM—TEasy载体上，得到重组质粒作为荧光定量 PCR检测的标准模板 ，以10倍梯度稀释模板，进行 SYBRGreenI荧光定量PCR扩增并制作标准 曲线，建立 PRRSV的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵 敏度可达 10拷贝／ ，与猪圆环病毒 、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒 不发生交叉反应，具有 良好的特异性和重复性 ；对 16份临床疑似病料进行了检测，发现 15份均为荧光定量 PCR阳性，而常规 RT—PCR只能检测出 12份阳性。结果表明，建立的实时荧光定量PCR具有特异 、敏感 、快 速 、定量、重复性好等优点，可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；GP5基因；实时荧光定量PCII；SYBRGreenI 中图分类号：S852．65 文献标识码 ：A 文章编号 ：1004—1524(2010)06—0745～05 EstablishmentandpreliminaryapplicationofaSYBR Green Ireal-timePCR method fordetectionofPRRSV YANG Chun．hua ．HUHui。ZHONGYi，HAN Zhi—tao ，ZHUJian—xin (]iangxiEntry—ExitInspectionQuarantineBureauofP．R．China，Nanchang330002，China；CollegeofAnimal ScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China) Abstract：PartialregionofthePRRSV GP5genewasamplifiedbyRT—PCR andclonedintopGEM—TEasyvector． SerialdilutionsoftherecombinantplasmidwereusedasstandardtemplatesforRT—PCRtoquanti~thevirusgenomic copynumber．ASYBRGreenIreal—timePCRwasdevelopedtodetectPRRSV．Sensitivityanalysisshowedthatthe developedSYBR GreenIreal—timePCRcoulddetect10copy／uL．Thespecificityassayexhibitedthattheotherpor— einepathogens，suchasPPV，PCV，JEV ，PRV，HCV andSIV couldnotbedetectedbythismethod．Thenthees— tablishedmethodwasusedtodetecttheclinicalsamples．Theresultsshowedthat15positivesamplesoutof16suspi— ciouspositivesamplescouldbeobservedbyreal--timePCR and12positivesamplescouldbedetectedbynormalRT-- PCR．Alltheresultssuggestedthatthereal—timePCR weestablishedincurrentstudyshowedthecharacteristicsof sensitivityandspecificity，andcouldbeusedinclinicaldiagnosisandepidemiologiealinvestigation．