图1利用假定的miR-21靶向基因（PDCD4PTEN和TLR2）的.pdfVIP

中国试剂网 3.14.1.123.14.1.11 通过实时荧光定量PCR 技术实现对miRNA 靶向物mRNAs 的相对定量分析 1 导言 小 RNA （miRNAs ）是一种内源性非编码蛋白的小分子RNA ，它们是许多基础 的细胞过程中基因表达的主要调节因子，这些过程包括细胞增殖、细胞分化以及 细胞凋亡等。miRNA 在肿瘤生长过程中也发挥着重要作用。一般来说，miRNA 通过控制翻译过程来实现对目标蛋白表达的调控。然而，在靶向mRNA 降解水 平上的基因表达的调控已有报道。因此，有证据显示miRNA 能够通过RNA 降 解来实现对细胞内 mRNA 浓度的直接调控，而且也会通过靶向作用于蛋白质级 联来调控mRNA 水平，这些蛋白质级联能够调控下游转录或在转录后对mRNA 水平进行调控。 在当前的研究中，我们重点关注miRNA hsa （人）miR-21 ，研究发现在乳腺癌和 其他肿瘤中miR-21 水平上调。更进一步的研究发现，miR-21 在细胞凋亡和细胞 生长过程中也发挥着功能性作用。为了进一步对miR-21 进行研究，我们研究了 miR-21 的水平对三个假定的miR-21 靶向基因（PDCD4 ，PTEN 和TLR2 ）mRNA 表达的影响 （见图1）。 图1： 利用假定的miR-21 靶向基因 （PDCD4 ，PTEN 和TLR2 ）的表达水平分 析从而对has miR21 进行分析的工作流程。 2 材料和方法 中国试剂网 3.14.1.11 细胞培养 DMEM 培养基中补充1%的L-谷氨酰胺，1%的盘尼西林/链霉素，10%的FBS ， 在+37 ℃ 5%CO2 条件下培养HeLa 细胞。用miRNA 21 miRIDIAN 类似物，miRNA 类似物miRIDIAN 对照，miRNA 21 mi RIDIAN 抑制剂和miRNA miRIDIAN 抑 制剂对照siRNA （dhar-macon 都为50nM ），以及X-tremeGENE siRNA 转染试剂 （罗氏公司），按照生产商的方案进行转染。 RNA 提取与逆转录 在转染之后两天，使用High Pure RNA Isolation Kit （罗氏公司），按照生产商的 建议从HeLa 细胞中提取总RNA （每个类似物miRNA 三个生物学复制）。同时， 使用High Pure miRNA Isolation Kit （罗氏公司），按照使用说明书上的指导，提 取包含小分子量RNA 在内的总RNA （两个生物学重复）（见图2 ）。按照生产商 的指导，使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit （罗氏公司）和oligo（dT ） 18 与随机六聚体引物的混合物，按照每次反应500 到 1000ng 总RNA 的量进行 第一链cDNA 的合成。用miRCURY LNA First-strand cDNA Kit （Exiqon ）进行 miRNA 第一链cDNA 的合成，每次反应使用4ng 含有小RNA 在内的总RNA 。 中国试剂网 3.14.1.1