MiR34b在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义研究.doc

硕士学位论文  论文题目  MiR-34b 在儿童急性白血病中的表达、 甲基化调控及临床意义的研究  研究生姓名 指导教师姓名  王 柴忆欢  娜 教授  专 业 名 称 研 究 方 向 论文提交日期  儿科学 儿童血液 2013 年 3 月 MiR-34b 在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究  中文摘要  MiR-34b 在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及 临床意义的研究 中文摘要 目的：研究 miR-34b 在儿童急性白血病中的表达及其启动子区 CpG 岛甲基化状 态，探讨其临床意义。同时检测 miR-34b 对细胞增殖是否有影响，进一步了解其生物 学功能。 方法：8 种白血病细胞株（U937，HL-60，MV4-11，M2R，K562，Raji，CCRF， DAMI），儿童初诊急性白血病（AL）患儿骨髓标本 87 例，其中初诊急性淋巴细胞 性白血病（ALL）患儿 55 例，初诊急性髓系白血病（AML)患儿 32 例，正常对照患 儿 43 例。提取细胞株或其骨髓标本总 RNA，并进行引物特异性逆转录成 cDNA，运 用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）技术对 miR-34b 进行检测，循环阈值(Ct 值)比较法 进行 miRNA 表达定量分析。统计分析白血病细胞株、初诊 AL、ALL、AML 及 MLL+ 各组患儿 miR-34b 表达是否有差异，并根据临床资料进行进一步分析，以探讨 miR-34b 在儿童初诊 AL、ALL 及 AML 的意义。同时提取细胞株或其骨髓标本 DNA，进行重 亚硫酸氢钠修饰基因组 DNA，运用甲基化特异性 PCR（MSP）检测 miR-34b 启动子 区 CpG 岛甲基化状态，并通过甲基转移酶抑制剂（5-aza-2-dC）处理 HL-60 及 K562 进一步检测其甲基化状态，结合临床资料进一步统计分析儿童初诊 AL、ALL 及 AML 与其甲基化状态是否相关。采用脂质体转染 hsa-miR-34b mimics 到 K562 细胞，通过 流式细胞仪检测转染效率，CCK-8 法检测细胞增殖情况。 结果： 1、miR-34b在正常对照、白血病细胞株、儿童初诊AL、ALL、AML及MLL+ 各 组的相对表达量(?x±s??x)分别为5.22±1.15、0.03±0.03、1.18±0.47、1.65±0.69、0.18±0.06、 0.64±0.34，与正常对照组相比，儿童初诊ALL组（P0.05）、白血病细胞株组、初诊 AL组、AML组及MLL+组（P均0.01）均有统计学差异。 I 中文摘要  MiR-34b 在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究  2、结合临床资料（如性别、年龄、免疫分型、染色体、融合基因、泼尼松实验 等）做了进一步分析，发现miR-34b的相对表达量与儿童初诊ALL患儿泼尼松实验敏 感与否相关（P0.05）。 3、miR-34b启动子在8种白血病细胞株中均出现甲基化现象，甲基化阳性率为 100%，本实验共检测50例儿童初诊AL患儿，其中31例初诊ALL患儿，19例初诊AML 患儿，其甲基化阳性率分别为64%（32/50）、77.42%（24/31）和42.11%（8/19）， 同时检测23例正常对照患儿，无一例出现甲基化现象。 4、5-aza-2-dC处理白血病细胞株HL-60及K562后，miR-34b的相对表达量均明显 升高，分别为49.5倍和18.8倍，其甲基化条带均明显减弱。 5、结合临床资料（如性别、年龄、免疫分型、染色体、融合基因、泼尼松实验 等）做了进一步分析，发现miR-34b的甲基化状态与儿童初诊AL患儿的免疫分型相关， 淋系与髓系的miR-34b的甲基化状态之间具有统计学差异（P0.05）。 6、脂质体转染hsa-miR-34b mimics到K562细胞后，流式细胞仪检测转染效率为 61%，CCK-8法检测各组细胞增殖情况，发现转染hsa-miR-34b mimics组48h、72h、 96h及120h均出现细胞增殖抑制作用（P均0.01），其中72h抑制作用最明显，抑制率 达45.7%。 结论： 1、miR-34b在白血病细胞株、儿童初诊AL、ALL、AML及MLL+各组患儿中表达 均明显减低，提示miR-34b可能作为新的抑癌基因参与儿童初诊AL、ALL及AML的形 成，同时在MLL基因重排阳性儿童初诊AL的发病中可能起着重要作用，并影响其预后。 2、miR-34b的相对表达量与儿童初诊ALL患儿泼尼松实验敏感与否相关，提示其 是否可以作为判定儿童初诊ALL危险度及预后的指标。 3、miR-34b启动子在白血病细胞株、儿童初诊AL、ALL及AML中均出现高度甲 基化现象，提示m