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第十章 细胞培养技术和培养箱cell culture and incubate 细胞培养技术的基本原理 细胞培养（cell culture）也称为组织培养（tissue culture），是从生物体内取出组织或细胞，在试管和培养平皿内模拟体内生理环境，于无菌、适当温度和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵育培养，使之保持一定的结构和功能，以便于我们观察研究。 培养细胞的类型及其特点 根据体外培养细胞能否贴附在支持物上生长的特性，可分为贴附型和悬浮型两大类。大多数培养细胞为贴附型，多呈上皮样或成纤维细胞样，具有接触抑制和密度抑制的特性。少数细胞在培养时以悬浮状态生长（包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞）。 培养细胞的类型及其特点 培养细胞的类型及其特点 (成人T淋巴细胞白血病细胞株) Molt4细胞悬浮2～3天的细胞图片 培养细胞的类型及其特点悬浮型培养细胞 培养细胞的增殖过程 传代（passage 或subculture）当细胞增殖至一定密度后，由于培养细胞的孤立生存环境和有限的营养，则需分离出一部分细胞接种到其他容器，并及时更新培养液，使细胞增殖继续过程。 一代 从细胞接种到下一次传代再培养的一段时间。细胞培养一代的过程中，一般细胞可倍增2～6次。 培养细胞的增殖过程 原代细胞培养 从供体取得组织，分离得到所需细胞后接种于培养瓶，进行首次培养。 次代细胞培养 将原代细胞培养物用胰酶和EDTA消化处理后，收集洗涤，再分装至含有新鲜营养液的培养瓶中继续培养，形成的单层细胞。 培养细胞的增殖过程 细胞系（cell line） 原代细胞一经传代后细胞。 无限细胞系或连续细胞系 细胞获得永生性即永久增殖的能力。 培养设备 技术方法 细胞的冻存和复苏-“慢冻快融” 冻存 选用对数生长期细胞，用常规方法收集按（1～5）×106/ml细胞浓度，悬浮于含10％DMSO或甘油的含血清培养液中，分装，封口，放入纱布小袋中。可用手工方法从把冻存管悬在液氮容器口开始，在30～40min时间内，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。或先将冻存管移入液氮罐口颈部气相中过夜，次日将纱布袋缓慢下降至液氮中，历时3min。在液氮中可长期保存。 复苏 将冻存于液氮中的冻存管取出，迅速放入37～40℃水浴中使其在1min内融化。在无菌条件下打开冻存管，取出细胞悬液至离心管中，补加10ml培养液，500～1000rpm低速离心5min，去上清，加入新鲜培养液适量，转入培养瓶中置37℃培养。 细胞培养微生物污染的检测 霉菌污染后，一般肉眼可见在培养液中形成白色或浅黄色飘浮物，短期内培养液多不混浊；倒置显微镜下可见于细胞之间悬浮飘荡在培养液中的纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝，很多菌丝在高倍镜下可见到有链状排列的菌珠；或可见散在细胞周边和细胞之间的卵圆形单细胞真菌。 细胞培养微生物污染的检测 细菌污染后，由于大量酸性物质产生，培养液短期内颜色变黄并出现明显混浊现象；倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量细小的圆球状颗粒飘浮，有时在细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞生长停止并有中毒表现。 支原体污染可做如下检测：①相差显微镜检测， 将细胞接种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间；②荧光染色法，用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258使支原体DNA着色，置荧光显微镜下观察，可见散在于细胞周围或附于细胞膜表面的亮绿色小点为支原体污染；③电镜检测，用扫描电镜或透射电镜观察支原体；④DNA分子杂交检测或支原体培养等方法，检出率高，但方法较复杂。 细胞培养应用 电热恒温培养箱 电热恒温培养箱适合于普通的细菌培养和封闭式细胞培养，并常用于有关细胞培养的器材和试剂的预温及恒定。 电热恒温培养箱有隔水式电热恒温培养箱和气套式电热恒温培养箱两种，两者基本结构相似，只是加热方式不同，前者的温度变化幅度比后者小，因而在使用上更具有优势。 恒温培养箱 电热恒温培养箱使用与注意事项 恒温培养箱使用步骤 隔水层的加水 温度设定 温度显示值修正 上限跟踪报警设定 控温仪的PID自整定控制 电热恒温培养箱使用与注意事项 隔水层的加水 第一次使用时，打开水龙头低水位指示灯亮且伴有报警声，当水位逐渐升高，低水位指示灯灭报警声消失时，应及时关闭水龙头。若溢水口有水溢出时,应把放水塞头拔出放水，同时观察溢水口，没有水溢出时应立即将塞头塞紧。直至低水位无声、无报警、没水溢出。 智能控温仪的温度设定 按控温仪的功能键“SET”进入温度设定状态，再按移位键配合加键或减键，设定结