第8章 紫外可见吸光光度法 及分子荧光分析法.pptVIP

* * * * * * * 2） 光电比色法 光电比色计结构示意图 通过滤光片分出一窄范围的光(几十nm，近似单色光)，照射样品池，测量的是吸收光的强度 吸收滤光片：只允许指定的窄范围波长光透过，其他波长的光均被吸收 光电比色法的局限性：（1）预先知道吸收波长 （2）单色光不纯 （3）只限于可见光 * 0.575 光源 单色器 吸收池 检测器 显示 2 分光光度法 特点：（1）可连续分出纯度较高的单色光 （2）精确，可选择最大吸收波长 （3）应用范围可扩展到紫外光和红外光区，对应称为紫外分光光度计、红外分光光度计 （4）可进行多组分的测定 * 单波长单光束分光光度计：一束单色光轮流通过参比和试样溶液，由于电源波动引起的误差较大——简易型分光光度计 0.575 光源 单色器 吸收池 检测器 显示 分光光度计的类型 * 单波长双光束分光光度计 比值 光源 单色器 吸收池 检测器 显示 光束分裂器 * 双波长分光光度计 ?2 ?1 A ? X Y ∵ ∴ Y 的存在不干扰 X 的测定 光源 单色器 单色器 检测器 切光器 狭缝 吸收池 * 分光光度计组件 光源 单色器 样品池 检测器 信号输出 氢灯，氘灯，185 ~ 350 nm； 卤钨灯，250 ~ 2000 nm. 基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定 （又称比色皿）玻璃，光学玻璃，石英，按其厚度分为0.5 cm，l cm，2 cm，3 cm和5 cm。 作用：将光信号转换为电信号，并放大 光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄像管（多道分析器） 表头、记录仪、屏幕、数字显示 作用：将复合光色散成单色光 光栅 玻璃， 350 ~ 2500 nm, 石英，185 ~ 4500 nm 平面透射光栅， 反射光栅 棱镜 * 氙灯 氘灯 钨灯 * 单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。 入射狭缝 准直透镜 棱镜 聚焦透镜 出射狭缝 白光 红 紫 λ1 λ2 800 600 500 400 棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同. 玻璃350～3200nm, 石英185～4000 nm * 光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。 利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。 波长范围宽, 色散均匀, 分辨性能好, 使用方便. －平面透射光栅 －反射光栅 光栅衍射示意图 M1 M2 出射狭缝 光屏 透镜 平面透射光栅 * 样品池：用于盛放分析试样（对液体试液） 要求：能透过有关辐射线，为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。 紫外光区：石英吸收池 可见光区：石英或玻璃吸收池 测定注意事项： 参照池和吸收池应是一对经校正好的匹配吸收池。因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。 使用前后都应将吸收池洗净，不能用手接触窗口（光面） 已匹配好的吸收池不能用炉子或火焰干燥 * 光电倍增管(Photomultiplier Tube, PMT) 1个光子可产生106～107个电子 160-700 nm * 不同光区的吸光光度法仪器主要差异比较 可见光 （380～780nm） 紫外光 （200～380nm) 中红外 （2.5～ 50 ?m ) 光源 钨灯 碘钨灯 320～2500 氢灯 氘灯 180～375 硅碳棒 （红外线） 吸收池 材料 玻璃 （350～3200） 石英 （185～4000） NaCl晶体 * 3 722型可见光分光光度计 光源：钨卤素灯－12V、30W 波长范围：330～800nm 分光元件：光栅，1200线/mm 检测器：端窗式G1030光电管 多碱阴极真空管 300～850nm 波长精度：2nm 光谱带宽：6nm 波长精度：仪器波长指示器所显示的波长值与仪器 对应输出的实际波长值之间的符合程 度。可用二者之差来衡量。 * 721或752可见光分光光度计的使用 ①打开光源，黄灯亮,预热10min ②用波长旋钮调λmax（或所选工作波长） ③打开样品池暗箱盖，断开光路，调满程（吸光度A=∞），透光率T=0 ④选择合适的参比溶液，合上暗箱盖，将参比池置于光路中，调零（A=0 ），T=100%, ⑤重复③和④至少两遍 ⑥测定标准溶液或样品的吸光度A * 波长选择旋钮 * * * 电源开关 * 比色皿 * * * * * * * * * * * * * * 二战期间，美国政府希望士兵得到较好的营养。但是当时，不知道食品中到底有什么维生素，有多少。在当时需要简便快速的测定方法。 1941年，第一台commercial available 的分