黄瓜花叶病毒检疫鉴定方法 编制说明.docVIP

附 录 A （规范性附录） 出入境检验检疫行业标准草案编制说明的编写模版（格式） 出入境检验检疫行业标准草案编制说明的编写模版 1 基本信息 1.1 标准草案名称 中文 黄瓜花叶病毒检疫鉴定方法 英文 Detection and identification of Cucumber mosaic virus 1.2 与国际标准和国外先进标准一致程度情况 等同 修改 非等效 标准号 英文名称 中文名称 1.3 任务来源 批准立项的文件名称和文件号 关于下达2012年第一批出入境检验检疫行业标准制（修）订计划项目的通知(国认科【2012】36号) 计划编号 2012B182 1.4 制（修）订情况 √制订 修订 替代的标准编号 1.5 起止时间 2012年1月～2013年12月 1.6 起草单位 深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、江苏出入境检验检疫局、重庆出入境检验检疫局 1.7 起草人 郑耘、卢小雨、张伟锋、向才玉、王红英、龙海、潘广、胡运发、李彬、孔德英 1.8 专业类别 4、植物检疫 1.9 标准体系表代码 1.10 调整情况 2 背景情况 2.1 目的、意义 黄瓜花叶病毒( mosaic virus, CMV)属雀麦花叶病毒科( Bromoviridae)属( Cucumovirus)世界分布，尤其是在温带地区,可侵染1000多种双子叶植物和单子叶植物，是禾谷类作物、牧草、木本和草本观赏植物、蔬菜及果树上发生最广，危害最大的病毒。花叶病毒幼苗期染病，子叶变黄枯萎，真叶表现出叶色深浅相间的花叶症状。成株期染病，症状在新出幼叶上表现最为明显，老熟叶片症状不明显。表现为在新出叶片上出现黄绿相间的花叶症状，叶片成熟后叶小，皱缩，边缘卷曲。果实上表现为瓜条出现深浅绿色相间的花斑，染病后瓜条生长缓慢甚至停止，果表畸形。发病严重时，植株矮小，茎节间缩短，使植株萎蔫。花叶病毒在田间主要通过以非持久性传毒方式近距离传播。机械、种子、花粉也能传播该病毒。花叶病毒通过带毒种子、苗木、组培苗等繁殖材料的运输发生远距离传播。花叶病毒CMV-F: 5-GTAGACATCTGTGACGCGA-3；下游引物CMV-R: 5-GCGCGAAACAAGCTTCTTATC-3。 1.3 特异性验证：将黄瓜花叶病毒、南瓜花叶病毒、西瓜花叶病毒、南芥菜花叶病毒、烟草环斑病毒各自接种在黄瓜上，提取RNA进行混样，进行特异性检测验证。 1.4灵敏度验证：将总RNA分别得到稀释10-1倍、10-2 倍、10-3 倍、10-4 倍的RNA稀释液,分别将其作为模板，确定检测的灵敏度。 1.5 重复性验证：检查五次检测结果的稳定性。 1.6 重现性:分别在ABI 9700、PTC-200、Bio-rad C1000-TOUCH、ABI-VERITTY PCR仪上，重复检测试验。检查重现性效果。 1.7 测序验证：通过与GENBANK中的BLAST比对，测序结果与已登录的CMV结果完全一致 5 验证情况（适用于方法类标准） 5.1 验证单位情况 验证单位 验证人员 验证时间 中国检验检疫科学研究院 张永江 2013年9月 厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心 廖富荣 2013年9月 海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 刘福秀 2013年9月 黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心 刘忠梅 2013年9月 广州出入境检验检疫局检验检疫技术中心 钟国强 2013年9月 5.2 验证过程 1、总RNA提取 称取样品 0.1g,液氮充分研磨。加入1 mL Trizol，混匀，倒入1.5mL离心管中。加入0.2mL三氯甲烷，剧烈震荡15s，4℃条件下 12 000g 离心10 min，小心吸取上层水相至新离心管中。加入等体积异丙醇，混匀，－20℃静止10 min，4℃条件下 12000 g离心15 min，弃上层水相。加入1 mL 75%乙醇，重悬沉淀，4℃条件下 8000 g离心10 min，弃上层乙醇相，干燥沉淀。加入30μL DEPC-H2O，置于50 ℃条件下5 min溶解沉淀，存于－80 ℃条件下备用。 cDNA合成：按下列组分制备RT反应混合液20 μL。反应条件：25 ℃温育20 min, 42 ℃反转录1.5 h, 95 ℃ 灭活2 min～3 min。 2、RT-PCR反应 2.1 引物 上游引物CMV-F: 5-GTAGACATCTGTGACGCGA-3； 下游引物CMV-R: 5-GCGCGAAACAAGCTTCTTATC-3。 2.2反应程序 在冰上依次将下列组分加入PCR反应管中，充分混匀后进入热循环反