入境环保微生物菌剂检测方法 第8部分：志贺氏菌 意见稿.docVIP

ICS点击此处添加ICS号 点击此处添加中国标准文献分类号 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T XXXXX— 进境环保微生物菌剂检测方法 第8部分：志贺氏菌 Methods for examination of import microbe agentia for environment protection Part 8: Shigella 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准按照GB/T1.1—2009起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：王金玲、栾慎顺、钟钰、于丽、王芳。 入境环保微生物菌剂检测方法 第8部分 志贺氏菌 范围 本标准规定了入境环保微生物菌剂中志贺氏菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR、实时荧光PCR检测方法。 本标准适用于入境环保微生物菌剂中志贺氏菌的检测和鉴定。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 方法原理 取适量入境环保微生物菌剂，经选择性增菌、分离，对疑似志贺氏菌进行形态学、生理生化、PCR扩增或实时荧光PCR扩增等试验，判定样品中是否含有志贺氏菌。 人员防护 取样人员在对微生物菌剂的取样过程中，参照我国病原微生物实验室生物安全管理条例，做好个人防护。为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测，所有培养物应小心处置。并参见GB19489中的有关规定执行。 主要试剂和培养基 实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规格）。 生理盐水：见附录A中A.1章。 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见附录A中A.2章。 麦康凯(MAC)琼脂：见附录A中A.3章。 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐(XLD)琼脂：见附录A中A.4章。 志贺氏菌显色培养基：见附录A中A.5章。 三糖铁(TSI)琼脂：见附录A中A.6章。 营养琼脂斜面：见附录A中A.7章。 半固体琼脂: 见附录A中A.8章。 葡萄糖铵培养基: 见附录A中A.9章。 尿素琼脂：见附录A中A.10章。 β-半乳糖苷酶培养基：见附录A中A.11章。 氨基酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.12章。 糖发酵管：见附录A中A.13章。 西蒙氏柠檬酸盐培养基: 见附录A中A.14章。 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录A中A.15章。 志贺氏菌属诊断血清。 生化鉴定试剂盒。 TE缓冲液（pH值8.0）：见附录A中A.16章。 溶菌酶（10 mg/mL）: 见附录A中A.17章。 蛋白酶K（20 mg/mL）：见附录A中A.18章。 10 %SDS：见附录A中A.19章。 3 mol/L乙酸钠：见附录A中A.20章。 dNTP: dATP、 dTTP、 dGTP 、dCTP。 TBE：见附录A中A.21章。 Taq DNA 聚合酶。 细菌基因组DNA提取试剂盒。 琼脂糖。 溴化乙锭。 DNA分子量标记：100 bp DNA ladder。 主要仪器和设备 电子天平（感量0.01 g）。 拍击式均质器 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 恒温水浴锅。 台式冷冻离心机（最高转速15000 r/min）。 PCR扩增仪。 实时荧光PCR仪。 微量移液器和灭菌吸头：10 μL、20 μL、200 μL、1000 μL。 高压灭菌锅。 PCR超净工作台。 电泳仪。 核酸/蛋白分析仪。 凝胶成像系统。 无菌培养皿：直径90 mm。 样品制备、培养 样品制备：以无菌操作取1 g（mL）样品加入到100 mL生理盐水中混匀，从中移取25 mL至盛有225 mL 灭菌生理盐水的无菌均质袋内，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。取样过程中，在样品旁边放置1个营养琼脂平板作为空白对照。 增菌：将上述样品匀液吸取25 mL，接种于225 mL志贺氏菌增菌肉汤中，经41.5 ℃±1 ℃厌氧培养16～20 h。 分离：取增菌后的志贺氏菌增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36 ℃±1 ℃培养20 h～24 h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48 h再进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌