箭毒蛙壶菌病检疫技术规范.docVIP

ICS SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 XX/T XXXXX—XXXX 箭毒蛙壶菌感染检疫技术规范 实时荧光PCR检测方法 Quarantine protocol for infection with batrachochytrium dendrobatidis by real-time polymerase chain reaction 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009的规则起草。 本标准国际动物卫生组织（OIE）水生动物疾病诊断手册（20版）2.1.1章。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国出入境检验检疫局、中华人民共和国出入境检验检疫局本标准主要起草人：本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。箭毒蛙壶菌感染检疫技术规范实时荧光PCR检测方法 1 范围 本标准规定了。 本标准适用于。 规范性引用文件GB/T6682-2008 《分析实验室用水规格和试验方法》 GB/T 18088-2000 《出入境动物检疫采样》 SN/T 1193 《基因检验实验室技术要求缩略语bp：base pair，碱基对。DNA：deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸。dNTP：deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸。Real-time PCR：real-time polymerase chain reaction，聚合酶链式反应。 Taq：Thermus aquaticu，水生热栖菌。Ct值：cycle threshold value。 3.8 FAM：荧光报告基团。 3.9 MGB：荧光淬灭基团。 设备和试剂 4.1 仪器 4.1.1 冷冻离心机 4.1.2 –20 ℃低温冰箱 组织器 PCR反应管 4.1.5 生化培养箱 PCR仪 GB/T 6682中一级水规格。 4.2.2 含有箭毒蛙壶菌的DNA或含有扩增区域序列的质粒。 4.2.3 TaqMan Fast Universal PCR Master Mix（含dNTP、Taq聚合酶和PCR反应缓冲液等）。 蛋白酶K酚/氯仿/异戊醇混合液（25: 24: 1）氯仿/异戊醇混合液（ 24: 1）75%乙醇附录A.附录A.最佳的组织是。核酸抽提 用经典的酚氯仿萃取法或商业化DNA提取试剂盒。 引物：5’-CCT-TGA-TAT-AAT-ACA-GTG-TGC-CAT-ATG-TC-3’； 5.8S: 5’-AGC-CAA-GAG-ATC-CGT-TGT-CAA-A-3’； 5’-FAM-CGA-GTC-GAA-CAA-AAT-MGB-3’； 5.4 PCR扩增体系 PCR扩增在标准的0μl的反应体系中进行，包括TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(2×) 25μL；μmol/L） 1μL；μmol/L） 1μL；μmol/L） 1μL；NA模板 5μL； 补水至50μL。PCR反应条件 实时荧光定量PCR反应包括以下步骤：）5℃ ２min； （2）95℃ 1min； （3）95℃ 30s，60℃1min，循环次。 阳性对照：。 阴性对照：不样品的扩增。 PCR检测阳性；测试样品检测Ｃｔ值大于或等于４２判为箭毒蛙壶菌实时荧光PCR检测阴性；测试样品检测Ｃｔ值介于40≤Ｃｔ≤４1之间，应调整模板浓度，重做实时荧光PCR。再次扩增后Ｃｔ值小于４２的判为箭毒蛙壶菌实时荧光PCR检测阳性，还可通过序列测定来对检测结果确证，序列参照PCR扩增rDNA的一段序列（GenBank Accession # AY598034），见附录PCR检测阳性；反之，判为箭毒蛙壶菌实时荧光PCR检测阴性。 （规范性附录）试剂的配制 A.1 TE(Tris-HCl、EDTA)缓冲液 1 mol/L Tris-HCl(pH8.0) 10 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2 mL 加双蒸水至1 000.0 mL，分装后高压灭菌备用。 A.2 浸泡液 储存液A： KH2PO4 136.0 g K