螯虾瘟检疫技术规范.docVIP

ICS 点击此处添加中国标准文献分类号 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 XX/T XXXXX—XXXX 螯虾瘟检疫技术规范 Quarantine Protocol for Crayfish Plague MOD （本稿完成日期：2013-10-30） XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中华人民共和国质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》的进行编写。 本标准修改采用了世界动物卫生组织（OIE）《水生动物疾病诊断手册》（201年版）第2..1章，主要修改如下：原文中Disease information”内容经修改简缩后作为本标准附录A； 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：本标准主要起草人：贾鹏、史秀杰、刘荭、郑晓聪、何俊强兰文升、本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 螯虾瘟检疫技术规范 范围 本标准规定了螯虾瘟的显微镜检病原分离PCR和实时荧光PCR的检测方法。 本标准适用于螯虾的检疫，也可用于的诊断、流行病学调查和监测。GB/T 6682 《分析实验室用水规格和实验方法GB/T 18088 《出入境动物检疫采样（）是A. astaci（Aphanomyces astaci）感染十足目螯虾科刺蛄科疾病 astaci属于藻界（Chromista）、卵菌门Oomycota）、卵菌纲Oomycetes）硅藻和褐藻类（Diatoms和Brown algae）。在日常检测过程中，根据宿主对螯虾瘟病原的敏感程度，检疫对象大致分为非北美螯虾和北美螯虾两大类（见附录A）下列缩略语适用于本文ITS：Internal Transcribed Spacer，核糖体DNA的内转录间隔区ITS1：Internal Transcribed Spacer 1，核糖体DNA的内转录间隔区1PCR：Polymerase Chain Reaction， 聚合酶链式反应CTAB：etyltrimethyl Ammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化胺UNG：uracil-N-glycosylase，尿嘧啶-N-糖基化酶Ct：cycle threshold，循环阀值。 仪器和设备 恒温培养箱 倒置显微镜 冷冻离心机 微量移液器 PCR扩增仪 实时荧光PCR仪 水平电泳仪 凝胶成像仪 超净工作台 试剂和材料 水：符合GB/T 6682中一级水的规格。株：由指定单位提供。 无水乙醇，分析纯，使用前预冷到-20 ℃。 70%乙醇及无水乙醇。 DNA聚合酶：-20 ℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP。 PCR用引物： 上游引物42：5-GCT-TGTGCT-GAG-GAT-GTT-CF-3′ 下游引物BO 640：5′-CTA-TCC-GAC-TCC-GCA-TTC-TG-3′ 扩增A. astaci bp片段。 A. astaci ITS1基因中大小为59 bp的片段。 临床症状 病虾失去正常的厌光性、独自游动、共济失调、腹部朝上且不易翻转。病虾透明软表皮下面的肌肉组织有白色和棕色坏死斑点，发病初期前腹部和足关节处变白。有时可见局部透明软表皮和肌肉组织有褐色黑化病灶，在病灶表皮上可见棕色菌丝向外延伸（见附录D.1）。 采样和制样 宜取活的、濒死或死亡不超过24 h的螯虾。若无法在24 h内将送达，按1：3（V/V）将样品固定于乙醇70 %）后送检。 无菌条件下，用手术刀切取易感部位的透明软表皮或肌肉组织，剪碎后涂于载玻片上，于倒置显微镜下观察菌丝和孢子的形态发生（见附录D.2）。鳌虾的易感部位包括胸腹部和尾部的软表皮、肛门周围表皮、尾部甲壳表皮、胸足关节处，特别是临近鳃和胸足的关节处。 可见7 μm~9 μm宽、无隔膜的菌丝；宿主血细胞和黑化组织包裹着菌丝；部分病例在宿主表皮的表面可见由初级孢子组成的大小为8 μm~15 μm、具有硬壳的孢子囊无菌条件下，用蘸有灭菌水的棉签或滤纸小心擦拭鳌虾的腹部软组织或其它可能被污染的部位。用无菌手术刀将病灶组织的肌肉或角质层横切下来，置于含有双蒸水的培养皿中轻轻漂洗后，将其切成3~5 mm2的小块，置于培养基（见B.1）表面，用封口膜密封后置于16 ~24 ℃培养。无菌条件下用刀片将菌丝连同其下一层薄的琼脂培养基一起切割下来，放置于含有池塘水的培养皿，池塘水体积约为菌丝的100倍。20 °C培养12 h~15 h或者16 °C培养20 h ~30 h，显微镜观察孢子囊从提取样品DNA，每一步骤均需要设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。取已知含有螯虾瘟病原的样品作为阳性对照；取的螯虾组织作