水产动物及其产品中乙烯雌酚、甲孕酮液相芯片检验技术规范 英文意见稿.docVIP

ICS 点击此处添加中国标准文献分类号 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 XX/T XXXXX—XXXX 水生动物及其产品中乙烯雌酚、甲孕酮液相芯片检验技术规范 Liquichip Detection technique for simultaneous detection of DES and MPA in Aquaitc Animals and Products 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 发布 前言 本标准根据GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》的要求编写。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：李健、王艳、邱璐、李小林、王巧全、熊炜。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 水生动物及其产品中乙烯雌酚、甲孕酮液相芯片检验技术规范 范围 本标准规定了水生动物及其产品中乙烯雌酚、醋酸甲孕酮的液相芯片检测方法。 本标准适用于水生动物及其产品中乙烯雌酚、醋酸甲孕酮的快速检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 缩略语 MPA 醋酸甲羟孕酮（Medroxyprogesterone Acetate） DES 乙烯雌酚（Diethylstilbestrol) SAPE 藻红蛋白标记的链霉亲和素（Streptavidin R-phycoerythrin conjugate) MFI 平均荧光强度（median fluorescence intensity) 试验原理 醋酸甲羟孕酮（MPA）是一种孕激素类药物，在兽药中被作为促生长剂，其对人具有广泛的毒副作用，能引起精神抑郁、过敏等不良反应，甚至引起乳腺癌和不孕不育症。乙烯雌酚（DES）是一种非甾体激素，曾被广泛用于促进动物生长、增加瘦肉率，作为主要的环境雌激素之一，具有导致畸胎、癌瘤等严重的毒负作用。本方法基于免疫学抗原抗体特异性反应原理。标准品或样品中的抗原能与荧光微球上耦联的抗原竞争性地结合定量的生物素化抗体（Bio-tin），加入藻红蛋白标记的链霉亲和素（SAPE）后，通过Bio-plex检测系统检测样品的平均荧光强度，平均荧光强度(MFI)与样品中的抗原浓度成反比，从而达到定量测定样品中MPA和DES的目的。 仪器材料与试剂 仪器材料 Bio-plex检测系统 微量移液器：20～200 μL 电子天平（0.01-100 g） 漩涡震荡器 37℃恒温箱 96孔低亲合力酶标板 微量离心管：1.5 mL 离心管：50 mL 试剂 本标准所用水应符合 GB/T 6682 中二级水的规格。下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。 乙酸乙酯 乙腈 DES、MPA标准稀释液（见附录A） 耦联有抗原的微球（制备见附录B） 生物素化的醋酸甲孕酮单抗及己烯雌酚单抗 藻红蛋白标记的链霉亲和素SAPE（1 mg/mL ） 终止液 商业货品（由指定公司提供） 稀释液等 见附录A 6 样品前处理 6.1 试样制备 6.1.1 鱼 用清水将鱼表面彻底清洗，取两侧肌肉，将鱼肉均质。 6.1.2 虾 用清水将虾表面洗净，去虾头，剥外壳，取虾肉，将虾肉均质。 6.2 提取 准确称取已匀浆的样品3.0 g，放入50 mL试管。加入9 mL乙酸乙酯，然后加入0.3 g CaCl2，最大转速振荡3 min；室温条件下，6000 rpm离心5 min；移取6 mL上清到另一新的试管，60-70 ℃水浴氮气吹干，残留物用2.0 mL的正己烷溶解，再加入1.0 mL的PBS-TBN pH 7.4（配制方法见A.1），漩涡振荡2 min；室温条件下，6000 rpm离心10 min，吸除上层正己烷，取25 μL下层溶液用于检测。 6.3将偶联有MPA和DES抗原的微球及其他试剂恢复至室温。 6.4将偶联有MPA和DES的微球 1μL/孔 (含500个微球)、系列标准品(25 ng/mL,12.5 ng/ mL, 6. 25 ng/ mL,3.125 ng/mL,1.6 ng/ mL, 0.8 ng/ mL, 0.4 ng/ mL)或样品提取液 25μL/孔与稀释好的生物素化抗体 25μL/孔加至相应的96孔酶标板，37℃，孵育，1h。 6.5加入稀释好的SAPE（10μg/mL），50μL/孔，37℃，孵育，0.5 h。