出入境口岸新甲型H1N1流感病毒检测 荧光定量PCR方法.docVIP

ICS点击此处添加ICS号 点击此处添加中国标准文献分类号 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T XXXXX—XXXX 国境口岸新甲型H1N1流感病毒检测-荧光定量PCR方法 Detection Method for novel Influenza A H1N1 virus RNA using real-time PCR at frontier port 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准依据GB/T1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：胡孔新 杨鹏飞 孙肖红 燕清丽 姚李四 杨宇 平芮巾 张丽萍。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。国境口岸新甲型H1N1流感病毒检测-荧光定量PCR方法 范围 本标准规定了国境口岸发现的具有发热或上呼吸道感染等疑似感染症状人员中新甲型H1N1流感病毒检测的生物安全要求、样品采集、运输和保存，样品处理，核酸提取及快速检测方法。 本标准适用于对国境口岸疑似感染人员携带新甲型H1N1流感病毒的检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 WS 233-2002 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 卫生部令第45号 可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定 术语与定义 下列术语和定义适用于本标准： 新甲型H1N1流感病毒 （ novel influenza A (H1N1)） 一种于2009年4月从墨西哥和美国病人体内分离到得新型病毒，该病毒属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）流感病毒属A型流感病毒。从基因组成来看，该病毒的基因组分来源于北美猪流感病毒、北美禽流感病毒、人类甲型流感H1N1亚型病毒和常见于亚洲欧洲的猪流感病毒。对于命名各国说法不一，该病毒爆发初期，常被称作猪流感（swine flu），另还有猪源流感、人类猪（型）流感、墨西哥流感、北美流感、H1N1新型流感、新流感、以及2009年H1N1流感。 2009年4月30日世界卫生组织将该病毒改称为新甲型H1N1流感病毒（2009）。 检测对象 国境口岸发现的具有发热或上呼吸道感染等疑似感染症状人员 实验室生物安全要求 检测工作中的个人防护参照GB 19489。 实验室应遵循GB 19489和WS 233-2002对生物安全2级（BSL-2）实验室的生物安全要求。 使用过的实验用品应遵照GB 19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。 准备 主要仪器设备及常用试剂见附录A 样品采集、处理与转运 样品采集 鼻(咽)拭子的采集 将灭菌棉棒插入鼻腔中，摩擦鼻甲数次，采集粘膜表皮获得鼻拭子;将灭菌棉从口腔完全插入咽喉中，以咽后壁、上颚扁桃的发红部位为中心，摩擦数次，采集粘膜表皮获得咽拭子（采集时，要注意不要触碰到唾液）。将棉棒头部浸入2 mL采集液中，折断尾部弃去；对采集的样本进行编号登记。 样品的保存 采集的新鲜的鼻（咽）拭子标本应保存在4℃条件下，24小时内运送至实验室；未能24小时内送至实验室的，应置-70℃或以下保存。 样品转运 实验样品转运过程应遵循下列原则： 所有需要转运的实验样品应存放在液氮罐中并标明“传染性物质”； 短途运输应使用专车，由专人运送。尽可能避免长途转运，如确需要空运的实验样品应按照有关部门对传染性物品运输的规定办理； 样品的容器需使用能够承受不少于95kPa压力的高质量的防水包装材料并且密封，以防止运输 过程中发生内容物的外泄； 疑似发热病人的样品包装应请参照卫生部令第45号 可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定的包装要求来进行； 几个易碎的容器在同一个包裹中运输时，应分别独立包装并相互隔离，以免相互碰撞。 国境口岸新甲型H1N1流感病毒检测-荧光定量PCR方法 新甲型H1N1流感病毒的核酸提取 核酸的提取采用天根生化科技有限公司TIANamp病毒RNA提取试剂盒进行)。将采集的样本平衡至室温。 用移液器吸取310 μL无核酸酶的水加入到310 μg的Carrier RNA中，使Carrier RNA彻底溶解，得到终浓度为1 μg/μL的Carrier RNA水溶液。 根据样本的数量（n），先吸取裂解液（n×0.56） mL，再吸取Carrier RNA水溶液