实验十一中药提取成分对于肿瘤细胞生长的影响分析指导教师.pptVIP

实验十一 中药提取成分对于肿瘤细胞生长的影响分析 1.实验目的 此综合性实验是通过细胞传代、绘制细胞生长曲线等基础实验来初步检验中药中的某活性成分的抗肿瘤活性。 2.实验原理 MTT比色法的主要原理是；MTT被活细胞中线粒体琥珀酸脱氢酶还原后，生成暗蓝色甲躜，甲躜被助溶剂溶解后，可在酶标仪上读取光吸收值 OD ，在一定范围内光吸收值 OD 与活细胞数量呈线性关系。所以可以通过测量OD值，间接测量活细胞数量。 其他见细胞的传代培养、细胞的生长曲线的绘制等实验内容 3.实验材料、用品 实验材料：Hela细胞，HL-60细胞等多种肿瘤细胞及原代培养的正常细胞。 实验用品：试剂：不同浓度梯度的重要某活性成分溶液。MTT（四甲基偶氮唑盐，5 mg/ml溶于PBS），SDS脱色液：0.01 mol/L HCl，10%SDS或DTW脱色液：1份Triton X—100溶于3份DMF（N, N-二甲基甲酰胺）中，摇匀，然后加2份去离子水，加柠檬酸至终浓度0.2mol/L，调pH至5～6。 其他：见细胞的传代培养、细胞的生长曲线的绘制等实验内容。 4.实验步骤 中药活性成分的分离、提取剂鉴定； 细胞的传代培养。 检测不同浓度梯度的重要活性成分对肿瘤细胞及正常细胞的生长曲线的影响（与未加药物组作对照）。方法：MTT法绘制生长曲线。 a 制备1 ml细胞悬液。空白对照以1 ml培养基代替细胞悬液。加入0.1 ml MTT 于37℃孵育4 h，使MTT还原为蓝紫色甲脯结晶。 b 加1 ml DTW脱色液，37℃至少静置30min（甚至过夜），使甲脯颗粒充分溶解。 c 吸取200μl该溶解液至96孔板孔中，在酶标仪上读取OD值，检测波长570nm，参考波长630nm。 d 每隔24h测量一个点，每个点为3个平行样品的平均值。 5.注意事项 每一样本组实验应重复三次。 MTT法的原理是测定细胞线粒体琥珀酸脱氢酶的活性。此法从根本上看是反映细胞的代谢和增殖活力，而非细胞数量。如果想用MTT法间接测量细胞数量，必须先用MTT法作出细胞数量和OD值相互关系的趋势线，在线性相关的范围内可间接测量细胞数量。在需要确知细胞数量的场合不宜用MTT法。 可结合科研，将课题组项目中研究的一些抑癌活性物质作为研究对象进行分析。浓度根据研究对象的不同，通过预实验来设定。 6. 思考题 分析实验结果，该中药成分对于肿瘤细胞的生长是否有作用？请设想一下怎样进一步验证其结果？ 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室 大连理工大学 环境与生命学院 指导教师：唐颖