L天冬酰胺酶与其单链抗体融合基因的构建、表达及融合蛋白稳定性研究.pdf

立鱼嫂圭生这鱼塞 摘 要 L一天冬酞胺酶(ASNase)在临床应用时所面临的一个重要问题是稳定性 差，体内半衰期短，导致体内半衰期短的主要原因是蛋白酶降解。为提高该 酶的稳定比尤其是对蛋白酶的抗性，/)本文根据以往的抗体稳定活性蛋白质 的研究成果，提出通过采用最新的拭体制备技术一噬菌体抗体库技术制备 ASNase的保护性抗体。从噬菌体单链抗体库中筛选得到ASNase的scFv46 可增强 ASNase对胰蛋白酶降解的抗性。ASNase/scFv46复合体经胰蛋白酶 于370C处理30分钟后，仍可保留70%的L一天冬酞胺酶的活性，而无scFv46 保护的游离的ASNase完全失活。克隆scFv46基因并构建pET-scFv46后， 在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达，scFv46的表达量约占菌体蛋白的45%, 表达形式为包含体，经变性、复性及纯化的scFv46抗体对ASNase仍有保护 性，保护作用经SDS结果得以验证。 构建重组质粒pET-SLA和pET-ALS，将上述得到的保护性scFv分别融 合ASNase的N末端和C末端，并两个分子之间由连接肤段(G1y,Ser)6连接， 在大肠杆菌中分别表达了scFv-ASNase和ASNase-scFv两种形式融合蛋白。 融合蛋白scFv-ASNase的表达形式是包含体，表达量占菌体蛋白的15.7%; 而融合蛋白ASNase-scFv大部分以包含体形式表达(表达量占菌体破碎沉淀 的10.4%)，少量以可溶性蛋白形式表达 (表达量占菌体破碎上清的2.3%). scFv-ASNase包含体通过变性、复性及纯化得到具有活性的融合蛋白，比活 为102iu/mg，为等摩尔天然ASNase活性的82%;融合蛋白ASNase-scFv 的可溶性部分经四步纯化后，测得其比活为20.5iu/mg，为等摩尔天然ASNase 活性的16.5%，并且发现融合蛋白ASNase-scFv主要以二聚体形式存在。 通过测定融合蛋白scFv-ASNase.ASNase-scFv及天然ASNase对蛋白酶、 高温及低pH的稳定性，发现融合蛋白scFv-ASNase和ASNase-scFv的稳定 性较天然ASNase的稳定性强，尤其scFv融合在ASNase的N端时稳定性增 强的效果最明显。例如，融合蛋白scFv-ASNase经胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶 和凝乳酶于370C处理30分钟后，仍可保留94%,88.8%和84.5%的酶活力; 相同条件下，融合蛋白ASNase-scFv可保留酶活为70.3%,68.1%及61.5%; 而天然ASNase的残留酶活为 0,15%及 12.7%。免疫检测实验结果表明融 合蛋白scFv-ASNase和ASNase-scFv的免疫原性较天然ASNase的强，但与 抗 ASNase的免疫血清的结合能力降低。此外，还将三者的基本的理化性质 进行了比较。将以上实验结果与计算机模拟融合蛋白三维结构及静电势表面 的分析结果结合起来，探讨了SCFV与ASNase融合后稳定性增强的机理。该 机理可理解为scFv的空间阻碍效应(包括封闭蛋白酶位点)与改变ASNase分 子的静电势表面的综合因素。/ 关键词:L一天冬酞胺酶，单链抗体，融合蛋白，克隆，表达，蛋白质稳定 1性，蛋白酶降解，结构模拟 郭丽博士学位论丈 V ABSTRACT Intheclinicaluse,L-asparaginase(ASNase)facestheseriousproblemthat itshalf-lifeisshortenedbyinactivationinvivo.Themostcommonformofin vivoinactivationofmanyproteinsisproteolysis.Inordertoincreasethestability ofASNase.particularly,enhnaceitsresistancetoproteolysis,weproposedto preparetheprotectivescFvforASNaseusingtherecentlyconstructedphage- displaynatibodylibrarytechnology.TheprotectivescFv46fragmen