VEGFA基因重组真核表达载体的构建与表达.pdfVIP

安 徽 医 药 AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2013Jan；17(1) ·45· VEGFA基因重组真核表达载体的构建与表达 吴 勇 ，刘学刚 ，郭嘉诚 ，李慧敏 ，丁周志 ，王亚明 ，宋 伟。，徐家丽 ，赵 武 (蚌埠医学院第一附属医院1．儿科；2．心胸外科 ；3．超声心动图，安徽 蚌埠 233004) 摘要：目的 构建 VEGFA基因重组真核表达载体pEGFP—VEGFA，并检测其在人胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达。方法 以人 脐血单核细胞的RNA为模板 ，采用 RT—PCR技术扩增 VEGFA基因，并将其定向插入真核表达载体pEGFP．N1中，构建重组真核 表达载体pEGFP—VEGFA。经限制性核酸内切酶 BglII和 SalI酶切和 DNA测序鉴定后 ，用脂质体法将 pEGFP—VEGFA转染 HEK293T细胞 ，转染后24h和48h采用荧光显微镜观察pEGFP—VEGFA的表达。结果 pEGFP—VEGFA被双酶切为4697bp 和 1251bp两条条带，测序结果证实 VEGFA序列与GenBank公布的VEGFAmRNA序列完全一致。在经转染的HEK293T细胞 内观察到较强的绿色荧光，表明pEGFP—VEGFA成功转染HEK293T细胞 ，并在其中得到了表达。结论 成功构建重组真核表 达载体pEGFP—VEGFA，为进一步研究VEGFA基因的生物学功能奠定了基础。 关键词 ：血管内皮生长因子 A；基因；遗传载体 Constructionandexpressionofrecombinanteukaryotic expressionvectorofVEGFA gene Wu Yong 。LIUXue．gang。GUOJia—cheng，etal (Departmentof1．Pediatrics；2．CardiothoracicSurgery，TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege，Bengbu 233004，China) Abstract：0bjective ToconstructarecombinanteukaryoticexpressionvectorpEGFP-VEGFA，andtodetectitsexpressionin HEK293Tcells．M ethods VEGFA genewasamplifiedfrom thetotalRNA ofhumanumbilicalcordbloodmonocytesbyRT—PCR nad thendirectionallyinsertedintotheeukaryotieexpressionvectorpEGFP—·N1inordertoconstructtherecombinantexpressionvectorpEG-· FP—VEGFA．TherecombinantvectorpEGFP-VEGFA wasidentifiedbyrestrictionendonucleaseBglIIandSaildigestionanalysis，andse— quenceanalysis．ThepEGFP—VEGFA wasthentransfeetedintotheHEK293Tcellbylipofectinreagent，anditsexpressionwasdetected byfluorescencemicroscopyat24 and48h post—transfection．Reslllts Th erecombinantvectorpEGFP—VEGFA wasdigestedintotwo bandsof4697and1251bp．SequencingresultsshowedthatthesequenceofVEGFAinpEGFP—VEGFA wasidentical toGenBankVEG- FA accessionnumberNM 001025366．StronggreenfluorescencewasobservedintheHEK293Tcellstransfeetedwithth