鼠抗人CD28分子功能性单克隆抗体研制及其生物学特性研究.pdfVIP

鼠抗人CD28分子功能性单克隆抗体的研制及其生物学的特性的鉴定 中文摘要 鼠抗人CD28分子功能性单克隆抗体的研制 及其生物学特性的研究 中文摘要 机体免疫应答过程的复杂性和严格的调控性，是由多种免疫细胞和免疫分子共 同参与而完成的。而免疫应答的核心是T淋巴细胞的活化。研究表明，诱导T淋巴 细胞活化、增殖及分化为效应细胞需要双信号刺激：第一信号来自抗原由TCR转导 并由粘附分子增强；第二信号即协同刺激信号由APCs表面的协同刺激分子和T细胞 的相应受体相互作用后产生。协同刺激分子主要分为免疫球蛋白超家族、TNF／TNFR 超家族及细胞因子超家族三种。B7／CD28属于免疫球蛋白超家族，其提供的第二信号， 是迄今为止公认的最基本的协同刺激信号。B7家族分子属于免疫球蛋白超家族，其成 和B7一H3等，主要表达于树突状细胞、单核细胞、朗格汉斯细胞、巨噬细胞和B细 胞等抗原递呈细胞(APC)表面。但近年来的研究证实，部分B7家族分子还表达于 关节炎病人的关节腔T细胞、系统性红斑狼疮患者的外周血T细胞、DC与T细胞共 胸腺细胞和部分NK细胞等。与其天然配体CDSO／CD86分子结合形成的协同刺激信号， 在免疫应答的早期发挥重要作用。其在降低T细胞活化阈值、调节细胞迁移和Thl／Th2 分化、诱导抗凋亡基因Bcl—XL表达、增加细胞因子IL-2的分泌、促进免疫突触形 成及阻止T细胞失能等方面均具有重要作用。对该信号进行选择性调控，可促使机 体对肿瘤的排斥和肿瘤细胞的杀伤，有助于自身免疫性疾病或超敏反应及异体器官 移植排斥的防治。另外，可溶性CD28分子在免疫应答和免疫调节中发挥何种作用， 在肿瘤、免疫缺陷病、自身免疫性疾病和器官移植等疾病的发生、发展、转归中又 鼠抗人CD28分子功能性单克隆抗体的研制及其生物学的特性的鉴定 中文摘要 有何意义，目前仍不清楚。因此，CD28功能性单克隆抗体的研制及可溶性CD28分子 检测方法的建立，为CD28及相关协同刺激分子的基础研究和肿瘤、移植排斥反应、 自身免疫性疾病等临床应用研究提供重要手段。 1．CD28单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究 1．1杂交瘤细胞的建株及亚类鉴定 以天然高表达CD28分子的人多发性骨髓瘤细胞株U266作为免疫原，经丝裂霉 素(㈨c)处理(50IX7细胞)后，免疫BALB／C小鼠，分颈部、皮下多点及腹 g／1×10 腔注射。采用B淋巴细胞杂交瘤技术，将免疫后的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞 株，同时以转基因细胞的母本细胞及不表达CD28分子的Daudi细胞作为阴性对照细 胞株，经HAT培养、间接免疫荧光分析和多次的克隆化培养及反复筛选，在融合的 72块96孔板中，最终获得5株持续、稳定分泌鼠抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细 冻存半年以上，复苏后仍生长良好，分泌抗体的性能稳定。 1．2单克隆抗体的制备、纯化及效价测定 采用本室建立的体内腹水诱生法制备单克隆抗体。将生长良好的杂交瘤细胞注入 的上清。小鼠腹水阳性形成率为90％以上，腹水收获量平均为7．4ml／只，个别小鼠达 25ml／只以上。经Protein G亲和层析法纯化抗体，抗体蛋白含量在1．2～4．7mg／ml 细胞反应，间接免疫荧光法分析，以出现同样阳性率的最大稀释倍数或最小蛋白浓度 为抗体的效价。结果表明，培养上清中单抗效价为1：200以上，腹水型单抗效价为1： 2000以上，纯化的抗体蛋白用于间接免疫荧光分析的用量为0．5u 10j细胞。 g／5X 1．3单抗识别的抗原位点及对不同细胞株膜型0D28分子的识别 U266细胞的结合，表明2D5和868与阳性对照单抗识别相同或相似的抗原位点：其 Il 鼠抗人CD29分子功能性单克隆抗体的研制及其生物学的特性的鉴定 中文摘要 余3株能部分阻断对照单抗与U266的结合，提示该3株单抗与阳性对照单抗识别不 同或不完全相同的抗原位