枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ZY-1)溶栓酶的分离纯化及其酶学性质.DOCVIP

临床医学论文-枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ZY-1)溶栓酶的分离纯化及其酶学性质 【摘要】? 目的 分离纯化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ZY-1)溶栓酶,探讨该酶的理化性质。 方法 枯草芽孢杆菌培养,利用(NH4)2SO4沉淀、Sephadex G-100 柱层析对该酶发酵液进行分离纯化,利用四肽底物Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA作为底物,研究酶的理化性质。 结果 经发酵并纯化后获得的酶液其比活高达26 400 U/mg,酶反应最适温度45 ℃,最适pH 8.0,且具有较好的热稳定性。 结论 枯草芽孢杆菌溶栓酶具有溶血栓作用。 【关键词】? 芽孢杆菌,枯草; 纤溶酶 ??? ABSTRACT:? Objective? Purification of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus subtilis ZY-1 and investigation of its activity and characterization.? Methods? A high fibrinolytic enzyme was purified with (NH4)2SO4 fractionation and sephadex G-100 gelfiltration chromatography, and characterization was investigated by check the enzymatic activities in different conditions.? Results? The specific activity of enzyme was 26 400 U/mg, and its optimal temperature and pH was 45 ℃ and 8.0, respectively.? The enzyme had fine thermal heat stability.? Conclusion? The enzyme had potential commercial value.??? 　　KEY WORDS:? Bacillus subtilis; plasmin ??? 目前常用治疗血栓病的药品有链激酶(SK)、尿激酶(UK)、重组组织纤溶酶原激活剂(t-PA)和尿激酶原(pro-UK)等［1］。但它们在不同程度上存在不足,如SK的抗原性强,不可连续用药超过7 d,UK虽然可连续使用半个月无抗原性,但体内半衰期仅3~20 min,且长期大量用药有全身性出血的倾向,口服一般无效［2-4］。1987年日本学者在传统发酵食品纳豆中发现一种由枯草芽孢杆菌产生的具有强烈纤溶活性的丝氨酸蛋白酶,定名为纳豆激酶(nattokinase,NK)［5］,该酶口服可通过肠道迅速吸收并释放入血,溶栓效率高,药效时间长,有望开发成新型口服溶栓剂［6-7］。本课题组在豆豉食品中筛选出一株产溶栓酶活性很高的枯草芽孢杆菌,探讨其产酶条件、提取工艺等以期提高其溶栓酶活性和产量。笔者报告该酶的分离纯化及其酶学性质。 　　1? 材料与方法 　　1.1? 材料? 　　菌株:依据中国豆豉生产方法,制作豆豉［8］,经发酵实验,从中筛选出1株在发酵产物中产生高纤溶活性蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ZY-1)作为出发菌株。试剂:凝胶Sephadex G-100(美国Pharmacia公司);底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(英国NEB公司);牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250(美国Amresco公司);其他试剂均为国产分析纯。LB培养基:1%胰蛋白胨,0.5%酵母粉,1%NaCl。固体LB培养基:1%胰蛋白胨,0.5%酵母粉,1%NaCl,2%琼脂粉。发酵培养基:2%大米粉,4%豆粕粉,0.04%CaCl2,0.4%K2HPO4,0.2%KH2PO4,0.07%MgSO4。在发酵培养基100 mL中接种液体菌种6 mL,37 ℃,摇床转速为180 r/min,发酵72 h。 　　1.2? 方法 　　1.2.1? 溶栓酶分离纯化? 　　取含溶栓酶的发酵液,经9 000 r/min离心、30%~70%(NH4)2SO4分步沉淀,9 000 r/min再离心,沉淀用0.02 mol/L Tris-HCl (pH 7.2)缓冲液溶解后透析浓缩得粗酶液［9］。Sephadex G-100 柱(上海华美实验仪器厂)层析分离纯化溶栓酶:按常规方法处理的Sephadex G-100装入层析柱(1.5 cm×45 cm),用0.02 mol/L HCl-Tris (pH 7.2)缓冲液平衡。将已