丹酚酸B对体外成骨细胞和骨髓基质干细胞作用研究.pdfVIP

丹酚酸B对体外成骨细胞和骨髓基质干细胞的作用研究 中文摘要 目的 课题组曾证明月参水溶性提取物能有效防治糖皮质激素引起的大鼠骨质疏 stromal 松，对糖皮质激素诱导的体外骨髓基质干细胞(Marrowcells，MSCs)的成 脂分化有抑制作用，丹酚酸B是丹参水溶性成分的主要有效成分之一，本研究 通过观察月’酚酸B对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞(osteoblast，OB)增殖、 分化的影响，以探讨丹酚酸B对骨细胞的作用及作用机制；通过观察月酚酸B 对骨髓基质干细胞成骨分化和成脂分化的影响，以探讨丹酚酸B对干细胞分化 方向的调节作用；通过观察丹酚酸B对骨髓基质干细胞成骨分化过程中一氧化 氮(N0)的影响，进一步阐明丹酚酸B的抗骨质疏松作用机制。 方法 1丹酚酸B对体外培养成骨细胞的影响：采用酶序列消化分离培养法培养新生 大鼠颅骨成骨细胞。应用MTT法、对硝基苯磷酸盐法、碱性磷酸酶染色法、茜 素红染色法、放射免疫测定法等方法鉴定成骨细胞和观察丹酚酸B对体外培养 新生大鼠颅骨成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶活性、骨钙素含量、骨结节数目和面 积的影响。 2丹酚酸B对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞方向分化的影响：密 度梯度离心法和传代贴壁筛选法相结合，分离纯化大鼠骨髓基质干细胞。基质细 胞成骨分化时，通过检测碱性磷酸酶活性、骨钙索含量和骨保护蛋白及其配体 mRNA表达，观察丹酚酸B对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响；基 质细胞成脂分化时，通过油红染色和检测脂质过氧化物体增殖物激活受体但 mRNA表达，观察丹酚酸B对大鼠骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化的影响。 3丹酚酸B对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化时NO途径的影响：选用传 代的大鼠骨髓基质干细胞，把细胞分成9组：阴性对照组、成骨诱导对照组、 量、碱性磷酸酶活性、骨钙素含量和骨保护蛋白及其配体mRNA表达，以评价 月酚酸B是否通过NO途径影Ⅱ向骨髓基质干细胞向成骨细胞方向分化。 结果 1丹酚酸B对成骨细胞的影响：丹酚酸B对新生大鼠成骨细胞的增殖没促进作 用，高浓度(104mol／L)时对成骨细胞的增殖有抑制作用。丹酚酸B可促进成 骨细胞表达碱性磷酸酶，lx10。7mol／L浓度组作用7天时效果晟明显。丹酚酸B可 刺激成骨细胞分泌骨钙素，在药物作用第13天时骨钙素分泌量最大。丹酚酸B 明显增加成骨细胞骨结节总而积，但对骨结节数量影响较少。 2丹酚酸B对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞方向分化的影响：结 合密度梯度离心法和传代贴壁筛选法，分离纯化得到较为均一的大鼠骨髓基质干 细胞，经诱导后可向成骨细胞和脂肪细胞方向分化。在没加入成骨诱导剂的情况 r，5×10。7mol／L浓度组的丹酚酸B可增加MSCs碱性磷酸酶活性，在加入成骨 诱导剂后，川酚酸B增加MSCs碱性磷酸酶活性的作用明显增加，其中 5×104mol／L浓度组作用最为明显。传代培养的MSCs培养22天也可以表达低浓 度的骨钙素。在没成骨诱导情况下，丹酚酸B也可以促进MSCs分泌骨钙素， 药物最佳作用浓度是5x10。7mol／L，在添加成骨诱导剂的情况下，丹酚酸B促进 RANKL比值增大。5x 诱导后PPART2的表达有抑制作用。 3丹酚酸B对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化时NO途径的影响：MSCs 成骨诱导后，细胞上清NO含量、碱性磷酸酶活性和骨钙素含量均增加，OPG 和RANKL的mRNA比值增加，与成骨诱导对照组相比，L-NAME通过抑制一 氧化氮合酶，抑制了MSCs的NO分泌，细胞上清NO含量明显减少，碱性磷酸 酶活性和骨钙素含量均减少，OPG和RANKL的mRNA比值下降。丹酚酸B能 增加骨髓基质干细胞上清NO含量，增加MSCs的碱性磷酸酶活性和骨钙素含量， B组明显增加药物作用第7天MSCs的碱性磷酸酶活性和22天骨钙素含量，使 骨抑制作用。 结论 丹酚酸B可促进成骨细胞表达碱性磷酸酶，促进骨钙素分泌，促进矿化结 节形成。丹酚酸B能促进骨髓基质干细胞向成骨细胞方向分化，表现为增加骨 mRNA比值增 髓基质干细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素含量，使OPG和RANKL 加。实验浓度的丹酚酸B对骨髓基质干细胞向脂肪细胞方向分化有影响，对 PPA聊2mRNA的表达有所抑制。丹酚酸B可促进成骨诱导的MSCs的NO分泌， 刺激骨