恒河猴表皮干细胞诱导分化为角膜上皮细胞体内外研究.pdf

’ “高楠颂士论文 摘要 摘 要 目的 在一定的诱导条件下，分别于体内外观察猴表皮干细胞横向分化为角膜上皮细 胞的情况。探索体内外诱导匾河猴表皮干细胞分化为角膜上皮细胞的可能性及诱导 分化条件，为构建组织工程角膜和治疗严重眼表疾病提供新型的种子细胞。 方法 1．采用组织块培养法和消化培养法分离培养恒河猴表皮细胞；用Ⅳ型胶原吸 附法分选表皮干细胞i分选后的细胞采用免疫荧光组织化学、逆转录一多聚酶链反应 细胞。比较两种标记方法的优缺点。 3．采用Transwell非接触共培养系统，用角膜上皮细胞和角膜缘基质组织与表 皮干细胞共培养lO天，检测诱导前后的表皮干细胞卢1整合素、角蛋白15、角蛋 表皮干细胞为对照。分别采用免疫组织化学染色和RT-PCR的方法鉴定。 。 4．制作恒河猴角膜上皮缺损模型，利用诱导分化3天并标记BrdU的表皮干 细胞为种子细胞，“去上皮”羊膜为载体，进行白体体内移植。对侧眼行单纯羊膜 l 移植。 8周后取材，进行苏木素一伊红(HE)染色、免疫组织化学检查BrdU、p 整合素、角蛋白15、角蛋白3／12和角蛋白1／10的表达。透射电镜检查术后植片的 超微结构。 结果 1．用Iv型胶原分选体外培养的表皮细胞，可获取10％左右的表皮干细胞。 经细胞免疫组织化学、RT-PCR和流式细胞仪鉴定，表皮干细胞呈芦l整合素、d6 整合索和角蛋白15阳性，CD71阴性。 高楠硕士论文 摘要 现象，不利于以后的移植实验；BrdU标记细胞较稳定，实验期间细胞内BrdU无明 显减少，标记率较高。 外，通过免疫组织化学染色和RT-PCR的检查，还发现卢l整合素和角蛋白15表达 水平较诱导前降低，但角蛋白3／12的表达则由诱导前的阴性转为诱导后的阳性。 4．BrdU标记表皮干细胞羊膜植片行自体眼表移植后8周，眼表上皮化良好： 荧光素不着染、角膜透明、新生血管少；组织切片AE5染色阳性，上皮和基底膜结 合紧密，上面4～6层复层细胞，胞核BrdU阳性，与正常角膜有相似组织学结构， 无结膜细胞侵入；超微结构显示细胞之间连接紧密，见桥粒结构，细胞与基底膜之 间见半桥粒结构。 结论 1．通过组织块培养法和消化培养法均可获得表皮干细胞，Ⅳ型胶原吸附法分 选表皮干细胞是一种简单、易行而且有效的方法，分选后的干细胞比例接近85％； 2．用非接触共培养系统，利用原代培养的角膜上皮细胞和角膜缘基质组织作 为微环境，成功诱导表皮干细胞转化为角膜上皮样细胞，证明了表皮干细胞的可塑 性。为利用表皮干细胞替代角膜缘干细胞，重建眼表及构建生物角膜进行患者自体 移植奠定了基础； 3．该研究的体内部分是将表皮干细胞与角膜缘基质及其上皮细胞共培养3天 后，再进行移植，可能提高表皮干细胞的转分化效率，增加移植成功率。表皮干细 胞与羊膜结合紧密，形成具有基底膜、复层上皮细胞，类似正常角膜上皮结构； 4．表皮干细胞羊膜植片移植后存活，角膜透明、无新生血管，表明移植后的 细胞具有角膜上皮细胞的功能。成功地重建了恒河猴眼表，具有良好的临床应用前 景。 关键词：表皮干细胞，可塑性， 角膜上皮， 组织工程， 眼表重建 Ⅱ 高楠硕士论文 Abstract ofRhesus Convert StemCells Monkey Epidermal and intoCorn