穴位埋线对拟阿尔茨海默病大鼠海马超微结构和胶质纤维酸性蛋白的影响.DOCVIP

临床医学论文-穴位埋线对拟阿尔茨海默病大鼠海马超微结构和胶质纤维酸性蛋白的影响 【摘要】? 目的： 探讨穴位埋线对拟阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease ，AD）大鼠海马CA1区超微结构和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的影响。方法： 采用冈田酸（Okadaic acid，OA）海马CA1区多次微量注射建立拟AD模型大鼠，应用肾腧（双侧）、大椎穴位埋线治疗；用Morris水迷宫实验检测动物的学习记忆能力，电镜观察海马神经元超微结构，免疫组织化学方法观察GFAP的表达。结果： （1） 模型组大鼠平均逃避潜伏期明显延长，第Ⅲ象限活动时间明显缩短及穿越站台次数明显减少，海马CA1区神经元超微结构有典型的凋亡改变，GFAP免疫反应阳性细胞明显增多；（2）穴位埋线组大鼠平均逃避潜伏期明显缩短，第Ⅲ象限活动时间明显延长及穿越站台次数明显增多，海马CA1区神经元凋亡现象改善，GFAP免疫反应阳性细胞明显减少。结论： 穴位埋线可能是通过改善AD模型大鼠海马的超微结构和降低GFAP表达的机制而提高AD大鼠的学习记忆能力。 【关键词】? 阿尔茨海默病 穴位埋线疗法 迷宫学习 海马 细胞凋亡 神经胶质原纤维酸性蛋白 阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease ，AD）是老年人常见的神经系统退行性疾病，以进行性认知障碍和记忆力损害为主要临床表现。AD的主要病理特征为老年斑（senile plaques，SP）、神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT）以及区域性神经细胞丢失。目前对于AD的病因病机及治疗方法仍无重要突破。针灸对AD的防治有确切的疗效 ，而穴位埋线对AD的治疗及有关机理方面的研究少见报导。本实验采用冈田酸（Okadaic? acid，OA）海马微量注射建立拟AD大鼠，观察肾腧及大椎穴位埋线对拟AD大鼠学习记忆的影响，并通过观察海马神经元超微结构及胶质纤维酸蛋白(GFAP)的表达，探讨穴位埋线影响学习记忆能力的作用机制。 ??? 1? 材料与方法 ??? 1.1? 实验动物? SD健康雄性大鼠45只，3～5月龄、体重(280±20)g，由贵阳医学院动物中心 [合格证号SCXK（黔）2002-0001] 提供，自然条件下饲养，自由饮食。 ??? 1.2? 试剂和仪器? Okadaic acid（OA）（美国Sigma公司），临用前溶解于10%二甲亚砜（DMSO）中，配制成浓度为0.4 mmol/L的溶液;抗GFAP多克隆抗体（基因公司）。研究用生物显微镜（德国Leica），日立－600型透射电镜（日本日立），Morris水迷宫。 ??? 1.3? 分组及复制拟AD模型? 大鼠随机分为3组：对照组，拟AD模型组（简称模型组），肾腧（双）及大椎穴位埋线组（简称埋线组），每组15只。所有大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉（30 mg/100 g）后，固定于大鼠脑立体定位仪上。参照大鼠脑立体定位图谱，将自行设计的十字形套管插入海马CA1区（前囟后3.6 mm，中线右侧旁开2.4 mm，深度2.7 mm），通过套管将OA溶液0.5 μl注入海马CA1区，隔天注射1次，共5次；对照组用同样方法注入等体积的对照液10% DMSO。 ??? 1.4? 肾腧、大椎穴位埋线? 埋线组大鼠于拟AD模型制作同时,常规消毒后在双侧肾腧穴和大椎穴，用8号针头埋入4/0号5 mm羊肠线，每7 d 1次。 ??? 1.5? 大鼠行为学检测? 实验于海马CA1区首次注射后的第4周开始。第1～6天进行定向航行试验，记录60 s内大鼠从入水中到爬上站台所需时间即逃避潜伏期。第7天进行空间探索试验，记录120 s内大鼠在第Ⅲ象限的游泳时间和穿越站台次数。 ??? 1.6? 灌注取材? 水迷宫试验结束后，各组取5只大鼠海马CA1区组织，用2.5%戊二醛和1%锇酸固定，环氧树脂包埋，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察海马CA1区神经元的结构。各组剩余大鼠经10 %水合氯醛麻醉后，生理盐水和10%中性甲醛灌注，断头取脑，置10%中性甲醛中浸泡固定。取海马注射点前后约3 mm厚标本，经脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋后行大鼠海马冠状位切片，片厚4 μm。 ??? 1.7? 免疫组织化学两步法? 切片脱蜡至水化， 3%H2O2孵育以灭活内源性过氧化物酶。切片浸入0.01 mol/L的TBS溶液（pH6.0）中，微波热修复。滴加抗GFAP多克隆抗体， 37 ℃水浴箱孵育。滴加通用型IgG抗体（Fab段）-HRP多聚体，使用DAB溶液显色；蒸馏水冲洗，复染，脱水，封片。 ??? 1.8? 显微镜观察? 采用Leica摄像显微镜观察并照像。计数每张切片4个随机高倍视野中GFAP阳性细胞数，取平均值作为计数结果，每组10张切片计数，取平均值作为最后