遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症及Wiskott-Aldrich综合征临床及分子致病机理研究.pdfVIP

遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症及Wiskott-Aldrich综合征的临床及分子致病机理研究 中文摘要 中文摘要 近年，随着人类基因组序列图完成及分子生物学技术的发展，几乎所有凝血 蛋白及血小板膜蛋白等基因已被克隆，这有助于深入了解探索其结构与功能的关 系。目前已发现很多遗传性出血性疾病的基因异常，基因诊断是今后遗传性出血 性疾病研究的发展方向。遗传性凝血因子Ⅶ缺陷为常染色体隐性出血性疾病，其 发病率约为1／500 综合征是WASP基因突变所致的X连锁隐性遗传病，其临床特征为血小板减少伴 小血小板，湿疹及免疫缺陷等。本研究对7例遗传性凝血因子Ⅶ及7例 分为两部分： 第一部分遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症的分子机制研究 第一节：7例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者及家系成员的临床 与F7基因突变的研究 用一期法及ELISA检测PT、凝血因子Ⅶ活性及抗原等凝血指标进行表型诊断； 用DNA测序方法对先证者及家系成员F7基因的全部外显子、侧翼区及5’和3’非 翻译区进行分析，寻找基因突变位点；应用PCR。RFLP对新发现地突变的先证者 及其家系成员相应基因片段进行酶切分析，证实测序所发现地突变：利用长链PCR 分析无突变患者的基因组DNA排除大片段缺失；并用剪接分析软件分析剪接位点 突变后效应。 在7例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者中，PT明显延长，FⅦ活性水平均降低( 5％)，FⅦ抗原水平改变不一致，有的明显下降，有的仅轻度降低，其他凝血指标 均J下常；7例遗传件FVII缺陷患者中发现7种基冈突变和3种F7基因多态性，其中 18094CT(GIn426X)、16750 中文摘要 Del 国际首次报道，His408Gln，5076．5077CT两种纯合突变为国内首次报道， 15975G—A(IVS6．1G—A)、16039 G呻A(Ar啦!2Gin)，17908 在两个无血缘关系的家庭中。除两例纯合突变外，其余均为双重杂合性突变；l例 Del 新的基因多态性10081C—T，其杂合率为4％。其中5076．5077CT纯合子、 明显临床出血表现。 从上述结果可得出以下结论，7例遗传性FVII缺陷患者中发现了7种基因突变， 其中2种突变为国际首次报道；IVS6．1G—A可能为中国汉族人的热点突变；但F7 基因突变、FVII活性及抗原水平及临床表现无明显相关性。 第二节新的错义突变Ser250Phe致遗传性凝血因子Ⅶ缺陷的分子机制 eDNA 及分泌合成受到影响。利用正常肝组织提取的mRNA构建正常(野生)FVII I消化模板，然后转化到感受态细胞(DH5 对反向互补的突变引物PCR扩增后，Dpn a)中修复。用脂质体法(Lipofectamine 过体外表达FⅦ活性及抗原的测定、Western Blotting分析、高尔基／内质网定位的质 粒及免疫荧光技术及分子模型分析等方法研究Ser250Phe致遗传性凝血因子Ⅶ缺陷 症的分子机制。 研究结果冠示突变体Ser250Phe转染细胞后，在细胞裂解液中能检测到与野生 型一致的FVll抗原量，但细胞培养上清中仅有极微量的FVll活性及抗原；亚细胞定 位分析中，突变体能与内质网及高尔体共定位；分子模型分析示Ser250被较大侧链 疏水的Phe替代后，改变了氢键位置并增大空间位阻，可能破坏了FVII的空间构象。 从上述研究结果可推出以下：Ser250Phe突变体构象改变，在细胞内能正常合 成，而且能从内质网转运至高尔基体，但分泌障碍而导致FⅦ的表达降低。 遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症及Wiskott-Aldrich综合征的临床及分子致病机理研究 中文摘要 用流式细胞术、免疫比浊法及血细胞分析仪分别检测各患者细胞免疫功能、 体液免疫功能及血小板计数及平均血小板体积；用DNA测序方法分析各患者 WASP基因的外显子、侧翼区与37与5’非翻译区，寻找基因突变，并与人类基