RNAi特异性抑制食管癌细胞cathepsin B基因表达的研究.pdfVIP

B基因表达的研究 RNAi特异性抑制食管癌细胞cathepsin 硕士研究生：娄欣 导 师：张红教授陈奎生教授 郑州大学基础医学院病理学教研室 河南省肿瘤病理重点实验室 河南郑州 450052 摘要 strand RNA干扰(RNA RNA, intcffefing 体(RNA-induccd silencing 属于转录后基因沉默(post·transcriptionalgene 用研究主要是利用体外合成siRNA和体内生成siRNA方法实施的，siRNA能明 显抑制目的基因的表达，而且特异性强，目前RNAi技术在抗病毒、抗肿瘤等实 验研究中被广泛应用。 B．Ca)是细胞溶酶体中的一种半胱氨酸蛋白酶， 组织蛋白酶B(cathepsin 能够直接降解或激活纤溶酶原激活剂及基质金属蛋白酶等而间接降解细胞外基 质成分，从而参与肿瘤的侵袭转移过程。研究表明，胃癌、肺癌、肠癌、乳腺癌、 前列腺癌、神经胶质瘤、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤和甲状腺癌等多种恶性肿瘤 组织中cB高表达且cB活性高于邻近正常组织。有学者认为，CB有望成为肿瘤 基因治疗的新靶点和辅助诊断的指标。 食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其浸润转移是导致患者死亡的主要原 因。有关CB表达与食管癌发生发展及浸润转移的关系研究少见文献报道；有关 采用RNAi技术抑制与食管癌浸润转移相关基因表达的研究尚未见文献报道。 本研究应用RNAi技术对食管癌EC9706细胞系CB基因进行抑制，检测抑 制后EC9706细胞中CB基因表达情况及侵袭力变化，为今后应用RNAi技术对 郑州大学2007届硕士研究生论文 RNAi特异性抑制食管癌细胞cathepsinB基因表达的研究 食管癌等恶性肿瘤进行基因治疗提供实验依据。 材料和方法 液在37℃、5％C02条件下贴壁培养。 2．siRNA的体外合成和鉴定：首先合成DNA模板，5’端为T7启动子序列，可 长度和浓度。 siRNATransfection 3．转染：应用LipofectamineTM2000Reagent将siRNA转染细 三个转染剂量及正常、空白、无关三个对照。 4．转染后检测：应用完整细胞原位杂交、免疫细胞化学方法检测细胞内靶基因的 chamber体外侵袭实验检测细胞体外侵袭力的变化。 表达情况，应用Boyden 5．统计方法：应用SPSS10．0统计软件进行统计学处理，资料以均数±标准差 (一X±S)表示，多样本均数比较采用方差分析。a=0．05为显著性标准。 结果 1．成功体外合成两段siRNA，长度为21bp。 2． 有所降低，以转染72h的抑制效应最为明显，三者两两相比，差异均无统计 学意义(尸O．05)；每个时间段内随剂量增]／[IsiRNA抑制效应均增强，三者 两两相比，差异均有统计学意义(PO．05)；正常对照、空白对照、无关对 照均未表现出对CBmRNA表达的抑制效应，实验组与3者两两相比，差异均 有统计学意义(PO．05)。 照有所降低，以转染72h的抑制效应最为明显，三者两两相比，差异均无统 计学意义(胗0．05)；每个时间段内随剂量增力IsiRNA抑制效应均增强，三 者两两相比，差异均有统计学意义(pO．05)；正常对照、空白对照、无关 对照均未表现出对cB蛋白表达的抑制效应，实验组与3者两两相比，差异均 Ⅱ 有统计学意义(P0．05)。 chamber体外侵袭实验结果：与正常对照、无关对照