西瓜花叶病毒HC-Pro基因在毕赤酵母中的分泌表达与功能研究.pdfVIP

维普资讯 23卷 6期 生 物 工 程 学 报 Vo1．23 No．6 2007年 11月 ChineseJournalofBiotechnology November 20o7 西瓜花叶病毒 HC-Pro基因在毕赤酵母中的分泌表达与功能研究 h on Secretion Expression in Pichia pastor~ and theHC．PI．oGeneofW atermelonMosaicVirus 张建新 ，吴云锋 ，王秀敏 ZHANGJian—Xin ，-，WUYun—Feng andWANG Xiu—Min 1西北农林科技大学植保学院与陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌 712100 2河南师范大学生命科学学院，新乡 453007 1ColllegeofPlantProtectionandShaanxiKeyLaboratoryofMolecularBiologyforAgriculture，NorthwestAFUniversity，Yangling712100，China 2Colelgeof Sciences，HenanNormalUniversity，Xinxiang453007，China 摘 要 利用RT—PCR方法扩增 出西瓜花叶病毒 HC-Pro的基因，长度为1371bp，并构建 了真核表达质粒pPIC9K—WHC。将重组 质粒经 SalI单酶切后 电转化 PichiapastorisGS115菌株 ，经 PCR鉴定与 G418、MD和MM培养基筛选 ，获得 Mut ／His表型高拷 贝转化子 。经 1％甲醇诱导 5d后 ，SDS—PAGE检测发酵液上清，在66kD处有一特异蛋 白条带表达 。Westernblot鉴定表 明，表达 蛋 白可 以和 HC—Pro蛋白抗血清发生结合反应。Far-Westernblot证 明该蛋白能与西瓜花叶病毒 cP蛋 白结合 ，支持 了HC—Pro蛋 白协助传毒 的 “桥梁”学说 。 关键词 西瓜花叶病毒 ，HC—Pro，毕赤酵母 ，真核表达 中图分类号 $432．4 文献标识码 A 文章编号 1000—3061(2007)06—1102—05 Abstract HC-pro gene ofWatermelon Mosaic viruswas obtained by RT-PCR was1371bp in length． Itwas cloned into pPI(9K，then the eucaryoticrecombinant expression plasmid pPIC9K—WHC wasconsturcted． Afterbeing lineafized with restrictionendonucleaseSalI，therecombinantplasmidwastransfomredintoPichiapastorisGS115byelectroporation．The highcopytransfomr antswith Mut ／His phenotypewereselectedby RT-PCR andscreeningon G418，MD and MM medium ． Inducedbymethanolfor5days，theculturesupernatantwasanalyzedbySDS—PAGE，theresultsshowedthataspecificprotein withamolecularweightofabout66kDwasexpressed．Westernblotanalysisprovedthattheexpressionproteincouldspecifically bindtoHC—Pro polyclonal antibody．Farwestern blotanalysisprovedthattheexpressionproteincouldbindtocoatprotein，given suppo