真菌诱导子对铁皮石斛原球茎诱导作用的研究.pdf

摘 篮 摘 要 真菌诱导子对铁皮石斛原球茎诱导作用的研究 博十生：侯丕勇 导师：郭顺星教授 (中国医学科学院中国协羽l医科大学药用植物研究所北京100094) 由于铁皮石斛繁殖能力低、生跃缓慢、成熟周期长，加上近年米的过分采挖，野 生资源已濒临枯竭。因此，用铁皮石斛组培苗或原球茎代替野生药材的研究在我国逐渐 引起关注。根据兰科植物与真菌共生形成菌根的特点，本文对真菌诱导子对铁皮年i斛原 球茎生长发育及其质量的影响进行了较系统研究。 选用24种真菌制成诱导子与液体培养的铁皮石斛原球茎共培养后发现：10号真菌 诱导予对原球茎生长量有提高作用，而其它真菌诱导子无影响；多种诱导子分别处理的 原球茎的提取物对T淋巴细胞增殖有促进作用，其中24号真菌诱导子处理的原球茎的 提取物既可促进淋巴细胞的增殖、也可抑制肿瘤细胞生长。通过对24号真菌形态学特 性的研究和ITS序列的分析，柳步确定24号真菌为小菇属真菌。 培养基添加24号真菌诱导予培养106小时，可以使液体培养的铁皮石斛原球茎总 生物碱含量比对照提高58．2％．薄层层析和高效液相色谱分析结果表明：24号真菌诱 导子处理的原球茎比处理前有7种新成分出现；其中有3种成分为野生铁皮石斛所特有。 采用液体．固体双重循环堵养方法实现原球茎的快速繁殖，并研究各个环节中原球 茎生长和发育的因素。研究结果表明选择1／2MS固体培养基、20％马铃薯提取液、3％ 蔗糖、pH5．8的培养条件对原球茎的生长较为有利：其中培养基中添加马铃薯提取液是 原球茎快速生长和BAP促进其分化苗的必要条件．pH6．0、添加灭活真菌的培养基上的 原球茎生长受到抑制：激素NAA可使原球茎生长量比对照提高16％。铁皮石斛原球茎 在液体培养体系(67．v)生长迅速、品质良好：由此获得的原球茎向固体培养转移的 最优培养基为全1／2MS固体培养基。 循环培养过程中筛选出了性状稳定的G、B、E、rip6原球茎株系：其中株系B和 Hp6的总生物碱的含量比普通原球茎(CK)高20％以上。而株系G的原球茎阶段稳定、 对真菌诱导子敏感。在此基础上，对原球茎株系G进行单一胚系筛选．选出的铁皮石 斛原球茎菡不发育株系(SUDP)的形态发生和发育速度一致的，性状稳定，适台作诱 导作用的实验。另外。研究还发现灭活的真菌、偏碱性的培养基、葡萄糖作碳源可使原 球茎分化苗的能力减弱；而激素BAP则与之相反。 诱导子对原球茎质量作用较好的参数为：pH5．6、基本培养基中加入15％的24号真 倍。 研究了24号真菌诱导子作用FSUDP原球茎培养基碱化作用的特点和同条件下酸 碱磷酸酶的活动情况。在24号真菌诱导子作用F，原球茎培养基碱化作用是一个多步 摘 耍 螺的过柑．)1。有两个j：升阶段。碱化的原田主要来源丁．原球笨细胞对诱导子的反应，而 不足培养蕊本身。在原球翠细胞的胞间迕丝、液泡膜和部分细胞膜部位，碱性磷酸酶活 性较强。碱性磷酸酶对原球鉴的表层细胞的细胞壁存渗透和侵蚀现象，侵蚀作月j位点与 原球苹表面粟胶层的分解和一些特异的细胞壁附属结构相荚联。酸性磷酸酶在原球摹细 胞肇人培沉秘，并发现部分酶渗入井分解胞间的中胶层，造成细胞分离。另外，原球竿 的一些衰亡中的细胞在核开始崩溃之后，也有酸性磷酸酶渗入中胶层的现象。 诱导子使得铁皮石斛原球茎内部细胞的细胞壁发生与其次生加厚相关的变形、加 厚和突起．进一步研究发现，诱导子引起的原球茎细胞壁的这种次生加厚与过氧化物酶 和光面内质网有密切关系。 扫描l毽镜观察发现，24号真菌诱导子处理的SUDP外部细胞的表面出现了圆形的 侵蚀斑，蚀斑周围的表面呈现絮状突起。这与许多已有报道的诱导作用中的植物细胞果 胶层改性和破坏的现象相符。另外，还发现24号真菌诱导子还引起液体培养的原球茎 表砸细胞的硬度降低_手【I表面萎缩。 研究了真菌诱导作用中铁皮石斛原球茎苯丙氨酸解胺酶(PAL)、脂氧合酶(LOx) 和过氧化物酶(POD)的动态变化过程。发现这三种酶在不同的诱导时间达到最大活性。 情形类似．研究还发现真菌诱导子对铁皮石斛原球茎不同株系PAL的诱导活性各不相 同。在此基础上对真菌诱导中的原球茎P