维生素A酸对小鼠囊胚TGF.DOCVIP

临床医学论文-维生素A酸对小鼠囊胚TGF 【关键词】? 全反式维生素A酸；,,转化生长因子 　　摘要：? 目的：探讨TGFβ1细胞因子对着床前胚胎发育的作用，从而探讨ATRA对着床前期胚胎发育毒性作用，为其致畸机理提供实验依据。方法： 通过促超排卵，获取妊娠3.5d小鼠囊胚，随机分成三组，即对照组（空白）、实验1组（含1μmol/L的ATRA）和实验2组（含10μmol/L的ATRA）， 分别培养在含0、1μmol/L 和10μmol/L的ATRA的M199培养基中，培养24h，然后再吸出囊胚。用免疫组织化学SP法，分别检测不同剂量组ATRA对小鼠囊胚TGF―β1蛋白表达的状况，利用HPIAS2000图像分析系统测定TGFβ1蛋白在以上三组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果： TGFβ1蛋白在囊胚细胞中的表达，实验1组与对照组囊胚TGFβ1蛋白表达的阳性面积率及平均光密度有显著性差异（P0.01）；实验2组与空白组和实验1组相比均存在显著性差异（P0.01）。结论：细胞因子TGFβ1在胚胎发育的调节中发挥了重要作用。 　　关键词：? 全反式维生素A酸；? 转化生长因子β1（TGFβ1）；? 囊胚；? 小鼠??? 　　维生素A酸（Retinoic acid,RA）即视黄酸，是维生素A即视黄醇(retinal，ROL)在体内氧化代谢的一类具有生物活性的产物。此外，维生素A酸在临床上也是用来治疗痤疮和其他许多皮肤病的重要药物。同时它也是用于一些恶性肿瘤联合治疗的药物之一，如卵巢癌、乳腺癌、白血病及肺癌等。但维生素A酸也是公认的致畸因子，许多动物实验已经证实在妊娠期间服用维生素A酸对胎儿的发育可产生重要的影响。RA对囊胚的这种致畸效应可能由于其诱导ICM和ＴＥ细胞过渡凋亡所致。而RA诱导囊胚细胞凋亡目前尚未见报道。本研究通过免疫组织化学方法研究TGFβ1蛋白在囊胚细胞中的表达。 　　1? 材料与方法 　　11? 材料 　　111? 试验动物? 一级健康昆明种小白鼠（SPF级），由武汉大学医学院动物试验中心提供。 　　112? 主要试剂和仪器? 孕马血清（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（HCG）为天津生物制品厂产品；ATRA购自上海第六制药厂；propodium iodide(PI)和bisbenzimide(Hoechst 33258)以及Triton100均系美国Sigma公司产品；M199培养基为美国Hyclone公司的产品；浓缩型兔抗人TGFβ1多克隆抗体DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸均购自北京中山技术公司；超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒系福州迈新公司产品。 　　12? 方法 　　121? 小鼠囊胚的获取 　　选用本校动物中心提供的一级健康昆明种小白鼠,雌雄各40只，体重(30±5)g，光照、黑暗各12h，自由摄食、饮水。于雌鼠腹腔注射10U PMSG，48h后再腹腔注射10UHCG促超排卵,当晚与雄鼠1:1合笼。次日晨检查阴栓，见阴栓者记妊娠0天。于妊娠3.5d时，将孕鼠脱臼处死，放入75％酒精中浸泡消毒约5min，于超净工作台上取出子宫，由阴道端插入7号针头注入M199培养基，冲出囊胚，一侧子宫可获取约10~20个。将所有的囊胚冲入凹皿中，并用PBS洗涤囊胚5min×3次。所有操作均在解剖显微镜下进行。 　　122? 胚胎培养 　　将所有囊胚随机的分为3组，即对照组（空白）、实验1组（含1μmol/L的ATRA）和实验2组（含10μmol/L的ATRA）。将囊胚培养在35mmFalcon塑料培养皿中，每皿加入1ml培养基，含有20个囊胚，实验1组中加入1μmol/L 的ATRA，实验2组中加入10μmol/L的ATRA，所有ATRA均溶于0.02%的DMSO。对照组只加等量的0.02%的DMSO。每组培养基均加入0.3%BSA，1 mmol/L 谷氨酰胺，并置入37℃，5% CO2 培养箱内培养24h。所有操作均在解剖显微镜下进行。 　　13?? 免疫组织化学SP法检测TGFβ1相关抗原 　　在解剖显微镜下，用毛细管吸出囊胚，并用PBS洗涤5min×3次，随后立即固定于4%多聚甲醛30 min，再用PBS洗涤5min×3次，最后转到涂有多聚赖氨酸的玻片上，干燥24h待用。免疫组化SP法主要步骤： 　　① 将载有囊胚的玻片用蒸馏水洗涤5min×3次； 　　②1% trironX100作用10 min，增加抗体的穿透性，蒸馏水洗涤5min×3次； 　　③ 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，蒸馏水和PBS各洗4×5min； 　　④ 正常羊血清37℃孵育35min以减少非特异性反应，甩干； 　　⑤ 一抗（TGFβ1，1:100；)37℃孵育1 h，4℃过夜。第二天于37℃下复温1h，PBS