人防御素α1基因（HNP1）在绿藻中表达研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 防御素是具有广谱杀菌活性的阳离子短肤，在哺乳动物中广泛分布，但自然提取防 御素成本极高，且产量极低，所以作为产品，通过基因工程的途径是必然的选择。本论 文通过单细胞真核藻类高效表达系统的建立，将抗菌谱较为广泛的人防御素 HNP-1基 因转入绿藻，旨在绿藻中生产防御素。为基因工程生产新型抗生素一防御素奠定基础。 本文由反转录 PCR方法 (RT-PCR)从人体外周血的总RNA中获得编码人 a一防御素 -I(a-IINP-1)的 cDNA。将。-HNP-1克隆到载体 pMD18-T中，获得克隆载体 PMD18-T/HNP-1。将其热转化至E.ColiJM109中，获得了a-HNP-1的cDNA克隆。 选择微绿球藻、亚心形扁藻作为表达宿主。研究了他们对抗生素的敏感性，结果亚 心形扁藻对氯霉素，微绿球藻对卡那霉素表现出敏感性，其敏感浓度皆为50wg/mlo选择 pBI121为表达载体，构建了两个表达系统。亚心形扁藻以氯霉素为抗性标记基因，工作 浓度为50Wg/ml,微绿球以卡那霉素为抗性标记基因，工作浓度为50wg/mla 电击法将表达载体 pB工121B/HNP-1,pB工121/HNP-1分别转入亚心形扁藻和微绿球 藻。在相应抗生素平板上筛选。获得了重组人。一防御素一1基因的亚心形扁藻和微绿球 藻。 制备重组a-HNP-1基因的两种绿藻的无细胞抽提液，进行抑菌实验，结果表明其对 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有不同程度的抑菌效果。 关键词:防御素，杭生素，克隆，转化，RTPCR,pBI121载体，绿藻 Abstract Defensinsareantimicrobialcationicpolypeptidesandspreadinmammalwidely.But thecostishighandtheyieldislowfortheextractofdefensinsfromtheorganisms.Soitis necessarytoobtainitbythewayofgeneengineering.Inthispaper,theexpressionsystems ofsingle-celleukaryoticalgaewereestablishedandHNP-1genewastransformedinto algaeinordertoproducedefensinandprepareforproducingnewtypeantibiotic-defensin bythewayofgeneengineering. ThecDNAofa-HNP-1wasobtainedfromthetotalRNAofhumanbloodby RT-PCR.Thefragmentofa-HNP-1wasclonedtopMD18-T,andtheclonedvector pMD18-T/HNP-1wasobtainedandtransformedintoE.colicompetentcellsJM109. NannochlorisoculataandPlatymonassubcordfiormiswereselectedasthehostof defensinandtheirsensitivitytoantibioticswastested.TheresultshowedthatPlatymonas subcor匆ormiswassensitiveto50}ig/mlchloromycetinandNannochlorisoculatawas sensitiveto50pg/mlkanamycin.Thentwoexpressionsystemswereconstructedwith vectorpBI121.The resistancemarkergene ofPlatymonassubcordiformisand Nannochloris.oculatawaschloromycetinandkanamycinrespectively.Theworking concentrationswereboth50pg/ml TwoexpressionsystemsofpBI121B/HNP一1andpBI121/HNP-1werethansformed intoPlatymonas