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山东农业大学硕士学位论文
中文摘要
马铃薯晚疫病是一种导致马铃薯茎叶死亡和块茎腐烂的毁灭性病害。利用植物抗病
基因培育抗病品种是当前生产上防控该病害的首选策略。本实验所利用的基因是从
Solanum mochiquense 中克隆的抗马铃薯晚疫病基因 Rpi-mcq1.1、Rpi-mcq1.2 和从 Solanum
venturii 中克隆的 Rpi-vnt1.1，它们都属于 CC-NBS-LRR 型的抗性基因，序列相似度高
达 82%，属于同一基因家族成员。通过改变结构域、启动子的方法，探索改良新基因的
可行性是本研究的主要目标。同时，实验设计中还可以帮助寻找抗病基因中决定特异性
识别病原菌的结构域，对进一步研究病原物与植物之间的互作起到一定作用。
利用结构域互换的方法，使用融合 PCR 技术将 Rpi-vnt1.1 CC-NB 区和 Rpi-mcq1.1
LRR 区组合（简称 V1M2）、Rpi-vnt1.1 启动子区与 Rpi-mcq1.1 、Rpi-mcq1.2 CC-NB-LRR
区组合（简称 RpiV::mcq1.1 和 RpiV::mcq1.2），构建了 3 个新的载体。
将三个融合基因连入 pCAMBIA1300 载体中，转入农杆菌工程菌 Agl，采用茎段
转化法将上述三个载体转化马铃薯栽培种 Desiree，分别获得 PCR 检测为阳性的转基因
植株 13 株、11 株、25 株，转化效率分别达到 73%、61%、79%。同时将三个载体转入
农杆菌工程菌 LBA4404。采用叶盘转化法将上述三个载体转化本生烟 Nicotiana
benthamiana，分别获得 PCR 检测为阳性的转基因植株 8 株、7 株、13 株，转化效率分
别达到 37%、30%、41%。所获得转基因植株可用于离体接种马铃薯晚疫病菌，对转基
因植株进行抗病性检测，以判断新抗病基因抗病谱变化以及与病原菌互作的结构域。
采用本生烟瞬时表达技术，利用农杆菌 GV3101 将 Rpi-vnt1.1、 Rpi-mcq1.1、
Rpi-mcq1.2、V1M2、 RpiV::mcq1.1、 RpiV::mcq1.2 分别与无毒基因 Avr2（E2、G3、G1）
混合共侵染本生烟，结果显示 Rpi-mcq1.1、V1M2、RpiV::mcq1.1、RpiV::mcq1.2 与无毒
基因 Avr2 的 G3、G12 菌株混合后产生反应一致，均有明显的 HR 反应，从而验证
Rpi-mcq1.1 识别病原物的位点在 LRR 结构域。尤其有趣的是，Rpi-mcq1.2 在低水平表达
下与 Avr2 不识别，但在换用 Rpi-vnt1.1 启动子后能和 Avr2 识别，与之前 35S 超表达结
果相符，说明，Rpi-mcq1.2 与 Avr2 的识别是处于弱蛋白质相互作用，为进一步分析
Rpi-mcq1.1、Rpi-mcq1.2、Rpi-vnt1.1LRR 结构域与病原无毒基因 Avr2 的识别奠定基础。
同时，在实验结果中我们意外的发现瞬时表达 Rpi-vnt1.1 能激发本生烟产生 HR 反
应 。 为 寻 找 Rpi-vnt1.1 自 激 活 现 象 中 发 挥 主 效 功 能 的 结 构 域 ， 我 们 构 建 了
pCAMBIA1300+Rpi-vnt1.1 启动子-CC-NB 区、pBin19s+35s 启动子+Rpi-vnt1.1CC-NBS
1
马铃薯晚疫病抗病基因的分子改造和水稻白叶枯病菌 IAA 合成途径相关基因鉴定
区、pBin19s+35s 启动子+Rpi-vnt1.1LRR 区、pBin19s+35s 启动子+Rpi-vnt1.1CC-NBS-LRR
区、pBin19s+35s 启动子+Rpi- mcq1.1CC-NBS 区、pBin19s+35s 启动子+Rpi- mcq1.1LRR
区、pBin19s+35s 启动子+Rpi- mcq1.1CC-NBS-LRR 区等载体，通过本生烟瞬时表达技术,
利用农杆菌 GV3101 侵染本生烟。实验结果显示只有 Rpi-vnt1.1 能自身激发本生烟产生
HR 反应。由此推测 Rpi-vnt1.1 自身激发本生烟产生 HR 现象可能与 Rpi-vnt1.1 自身启动
子结构域有着必然的联系。为进一步解析相关自激活机制奠定基础。
生长素（auxin）是一个至关重要的植物激素，调节植物生长发育过程中的多个方面。
天然植物生长素的主要活性形式是吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)。由水稻白叶枯
病菌引起的水稻白叶枯病是世界水稻最重要的病害之一，每年给世界粮食生产造成巨大
的损失。近期研究表明 IAA 不仅调节水稻的生长发育，而且可作为白叶枯病菌侵染水稻
的毒性因
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