新型生物分子固定技术用于构建电化学免疫传感器研究.pdfVIP

摘要 长期以来， 由于电化学免疫传感器具有设计制造简单、高灵敏度、价格低廉而被广 泛研究并已在生物检测中逐步得到了应用。然而，如何将生物活性组分有效地固定在电 极表面上的固定化方法、降低甚至消除蛋白质在传感器上的非特异性吸附以及免疫传感 器的重现性和重复使用性能等方面存在的问题阻碍了电化学免疫传感器的发展和应用。 其中有效的生物活性组分的固定方法是构建性能优良的生物传感器的关键步骤，据此本 研究论文发展了五种新型的生物活性组分在电极上的固定化技术，并以此来构建电化学 免疫传感器。主要内容如下： (1)在第二章和第三章发展了基于邻氨基硫酚在金电极上进行自组装和电催化 聚合形成低聚合物膜技术的电容型电化学免疫传感器。采用邻氨基硫酚低聚合物膜固定 生物活性组分，构建电容型免疫传感器的优势在于一方面其表面存在自由的氨基可以用 戊二醛活化或结合纳米金来固定抗体构建电容免疫传感器；另一方面，邻氨基硫酚低聚 合物膜可完全封闭金电极表面， 而且所形成的低聚合膜为一种有机半导体膜，可赋予 传感器具有较高的初始电容值，以提高其检测范围及检测灵敏度。采用循环伏安法研究 这类传感器的基本性能如法拉第电流效应、离子的不可通透性等，均表明该低聚合膜能 很好的满足构建电容免疫传感器的要求。采用恒电位脉冲计时安培法可确定传感器的电 容值，实验结果表明，用戊二醛活化邻氨基硫酚低聚合物膜固定转铁蛋白抗体而构建的 传感器，对溶液中转铁蛋白检测的浓度的线性范围为1．25—80．0 ng／ml，检测下限 为0．12 ng／ml。而采用结合纳米金来进一步固定转铁蛋白抗体所构建的电容免疫传 感器，对溶液中转铁蛋白的测定的浓度线性范围为0．1—1000ng／ml，检测下限达0．08 ng／ml。 (2)K型角叉皂素(K—LC)为带磺酸基的天然聚电解质，足一种具有强电负性的 物质，将K—LC与蛋白质偶联，可以增强蛋白质的负电荷性而使通过静电自组装技术 固定的蛋白质的稳定性得到提高。本论文的第四章采用此技术构建了亲和柱用于流动免 疫分析方法检测了溶液中NHIgG，其检测的浓度的线性范围为O．1—1000ug／ml，该 亲和柱用于免疫分析具有重复性较好、非特异性吸附影响低等特点。 褐藻酸钠与壳聚糖之间可通过静电自组装而形成牢固的小分子可透过性的天然高分 子膜。可利用褐藻酸钠这～特性可构建电化学免疫传感器，即将褐藻酸钠通过EDC活化 与目标生物活性组相联，将壳聚糖通过包埋技术固定在碳糊电极里：这样，负载有生物 活性组分的褐藻酸钠与固定在电极表面的壳聚糖分子之间发生静电自组装的同时也将 摘要 生物组分固定到电极表面而完成了电化学免疫传感器的构建。第五章描述了采用该技术 固定日本血吸虫抗体构建了一种新的日本血吸虫电化学免疫传感器。实验结果表明该传 Mg 感器对日本血吸虫抗原检测的浓度线性范围为0．64—40“g／ml，检测下限为0．40 ／ml，且该固定化方法具有重复性好、蛋白质的非特异性吸附影响较低的特点。 (3)Tris改性的褐藻酸钠或通过胱胺而固定在金电极表面上的TriS改性的褐藻酸 钠在Ca2+存在下引发固定抗体构建了电化学免疫传感系统和免疫传感器。通过对转铁蛋 白免疫反应体系来评价这两种技术固定抗体技术的可行性。实验证明此免疫传感器具有 重现性好、重复使用性能良好及蛋白质的非特异性吸附影响低等特点。用该传感器检测 溶液中转铁蛋白的浓度的线性范围为0．2—30“g／ml，其检测下限可达0．08¨g／TI)1； 而采用免疫传感系统分析转铁蛋白的浓度线性范围为5．0—35“g／m1，其检测下限为 2．3肛g／m1，也具有蛋白质的非特异性吸附影响低等特点，但实验操作较传感器稍繁 琐。 (4)纳米金(胶体金)可用于吸附固定抗体，己在免疫分析中得到广泛的应用。近 年来的研究发现，纳米金能降低～些物质在电极上发生反应的氧化还原电位，并催化这 些物质在电极上的电化学氧化还原反应。利用纳米金的上述特征，第八章设计了非标记 的电化学免疫传感器用于直接测定溶液中的对氧磷含量。研究发现在纳米金存在下，对 氧磷分子上的硝基能在一165mV的电位下被还原，在一0．8mY电位下可被