花生四烯酸细胞色素P450表氧化物酶基因对高脂饮食诱导小鼠动脉粥样硬化的保护作用和机制研究.docVIP

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 花生四烯酸细胞色素P450表氧化物酶基因对高脂饮食诱 导小鼠动脉粥样硬化的保护作用和机制研究 中文摘要 华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科 硕士研究生 吴俊 研究生导师 汪道文教授  研究背景和目的： 动脉粥样硬化(atherosclerosis  AS)所致的心血管疾病是严重危  害人类生命健康的疾病之一。因此，研究动脉粥样硬化的发病机制，并找到相应的预 防及治疗方法，对冠心病防治有着非常重要的意义。越来越多的证据表明动脉粥样硬 化是慢性炎症性疾病，炎症反应伴随着动脉粥样硬化的发生、发展直至其斑块破裂的 整个过程，众多的细胞和化学因子参与其中，血管内皮细胞功能障碍被认为是动脉粥  样硬化发病的早期关键性环节。 花生四烯酸（arachidonic  acid  AA)是人体内多  种重要心血管活体物质的前提，其代谢产物对心血管系统有显著的保护作用，包括作 为超级化因子舒张血管、上调一氧化氮合酶保护血管内皮细胞、抗炎、抗凋亡和促进 血管生成等,这些对于改善动脉粥样硬化有重要的作用。那么花生四烯酸细胞色素 P450表氧化物酶（cyptochrome P450 expoxygenase CYP450）代谢产物环氧化二 十碳三烯甘油酸(Epoxyeicosatrienoic Acids EETs)对动脉粥样硬化是否有治疗作 用？本文旨在高脂饮食诱导小鼠动脉粥样硬化模型中研究CYP2C8基因对动脉粥样 硬化的作用及相关机制。 方法：雄性内皮特异性CYP2C8转基因小鼠(CYP2C8Tg+/-)与雌性C57BL/6小鼠杂交， 获得 CYP2C8Tg+/- 小鼠和 C57BL/6小鼠；雄性内皮特异性 CYP2C8转 基 因 小 鼠 (CYP2C8Tg+/-)与雌性APOEKO-/-小鼠杂交，获得APOEKO+/- CYP2C8Tg+/-小鼠和 APOEKO+/-小鼠，这四种小鼠按照Zeldin实验室提供鉴定方案鉴定小鼠基因型。将5 -1- 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 周断乳的雄性小鼠随机分组，并开始高脂饮食喂养至20周和40周。各组小鼠于第5、 15、20、30、40周内眦静脉采血，测非空腹总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆 固醇浓度；在第5，20，40周时各组动物留尿，用ELISA法检测各组动物EET含量； 于第5、10、15、20、25、30、35、40周测各组体重。在20周和40周处死动物留取 主动脉做oil red O染色， 观察主动脉斑块形成情况。在20周和40周处死动物用ELISA 法检测各组小鼠的血浆IL-1β和IL-10，用Real-time PCR法检测各组小鼠的主动脉 PPAR-γ、MCP-1、TNF-α、IL-6、MMP-9基因表达水平，Western blot分析各组小鼠 的主动脉（p-）eNOs、 NF-κB 和MMP-9蛋白的表达与小鼠的肝脏PI3K、(p-)AKT、 (p-)ERK和(p-)P38等信号通路蛋白的表达情况。 结果：与正常饮食组比较，高脂饮食在20周成功诱导成动脉粥样硬化。在高脂饮食中， CYP2C8Tg+/-组和 APOEKO+/- CYP2C8Tg+/-组的 TG和 TCH浓度分别明显低于 C57BL/6组（P0.05）和APOEKO+/-组（P0.05），CYP2C8Tg+/-组和APOEKO+/- CYP2C8Tg+/-组的HDL浓度分别明显高于C57BL/6组（P0.05）和APOEKO+/-组 （P0.05）。在高脂饮食中，CYP2C8Tg+/-组和APOEKO+/- CYP2C8Tg+/-组的主动 脉斑块形成的指标分别明显低于C57BL/6组（P0.01）和APOEKO+/-组（P0.01）； 40 周 APOEKO+/- 组 的 主 动 脉 斑 块 形 成 的 指 标 明 显 高 于 20 周 APOEKO+/- 组 （P0.05）。在高脂饮食中，CYP2C8Tg+/-组和APOEKO+/- CYP2C8Tg+/-组的EET 浓度分别明显高于C57BL/6组（P0.01）和APOEKO+/-组（P0.05）；各组的40周 EET浓度分别明显高于20周（P0.05）。Western blot分析结果显示：高表达CYP2C8 在肝脏中明显上调PI3K、(p-)AKT、(p-)ERK和(p-)P38蛋白的表达；在主动脉明显上 调（p-）eNOs蛋白的表达，下调NF-κB和MMP-9蛋白的表达。Real-time PCR分析显 示高表达CYP2C8在主动脉中明显上调PPAR-γ蛋白的表达，下调MCP-1、TNF-α、IL-6 和MMP-9蛋白的表达。在血清学上，高表达CYP2C8明显上调IL-1