脆性X综合征分子诊断方法体系的建立及其疾病基因新型可变剪接转录产物的鉴定.pdf

脆性X综合征分子诊断方法体系的建立及其疾病基因 新型可变剪接转录产物的鉴定 中文摘要 Xsyndrome，FXS)是一种常见的遗传性智力障碍疾 脆性X综合征(fragile 病。1991年在Xq27．3处克隆了该病的疾病基因——脆性X智力障碍1基因 l Xmentalretardation (fragile 显子和16个内含子组成，编码一功能未明的RNA结合蛋白。已证实FMRl基 因存在多种可变剪接方式，主要涉及四个外显子，并且在不同组织中其剪接形 式并非一致，但其具体的功能仍未明确。同时，FXS发病率高、临床表现复杂 多样、并存在传递扩展的遗传特性，因此，建立完善的实验室诊断方法尤为重 要。 本研究依据FMRl基因突变的特点，分别从基因组DNA和mRNA两条途 径建立FXS分子诊断方法。采用甲基化特异性PCR，从基因组DNA途径检测 技术，以eDNA为模板，扩增FMRl基因编码区全长序列，再分4个片段进行 二次PCR，并对PCR产物直接测序。利用上述方法对一疑似FXS患者及其家 系成员进行了检测。 同时，本研究利用克隆．测序技术，从RNA水平对该患者外周血FMRl基因 的可变剪接产物进行分析。利用长链RT-PCR扩增FMRl基因编码序列，并将 其插入T克隆载体进行序列测定，进一步分析剪接异构体表达情况。结果显示： 在所检测的19个克隆中存在11种剪接转录产物，其中发现6个涉及FMRl基 因内含子9部分片段的插入的剪接转录产物(6／19)。针对新发现的FMRl基因 内含子9部分片段的插入的剪接方式，本研究利用生物信息学技术对FMRl基 因内含子9序列进行剪接信号相关分析，证明该内含子插入片段可能为一个隐 2 exoll)。同时，分析结果显示，该隐秘外显子的出现，提前 秘外显子(cryptic 引入终止密码子，可能通过NMD途径导致转录产物降解，使功能性FMRP减 少。 本研究还利用克隆．测序技术，以四个正常人外周血样本和一份脑组织cDNA 文库为模板，进一步分析了FMRl基因剪接转录产物表达情况。结果显示：在 所检测的四个正常人外周血中共检测到16种剪接产物，不同个体存在不同程度 的FMRl基因剪接表达，并在一个正常人中发现两个未曾报道过的剪接产物； 而在脑组织中共检测到9种剪接产物，并从中发现一个涉及外显子15一个新的 剪接受点的剪接产物。 本研究建立的一套FXS分子诊断方法体系，将为FXS的临床诊断、产前 诊断和遗传咨询提供可靠的科学依据。发现的新型可变剪接转录产物，将为研 究FMRP功能、FXS发病机制奠定基础。 关键词： 脆性X综合征；FMRl基因；可变剪接：生物信息学； 可变剪接外显子 of forMolecular of X Establishment Methodology DiagnosisFragile andIdentificationofNovel Syndrome AlternativelySpliced itsDiseaseGene of Transcripts Abstract themostcommoninheritedmentalretardationdisorder． X is Fragilesyndrome The Xmentalretardation1 disease-determininggene，fragile gene(FMRl)，Was in1991．This 38kbinthe a