蛇毒抗血小板溶栓素生化基础、基因结构和作用机理研究.pdfVIP

摘 要 本文从生物化学和分子生物学的角度研究了具有很好抗血栓作用机制和临床应用前景 的、从皖南尖吻蝮蛇毒中分离纯化得到的抗血小板溶栓素。应用现代下游纯化技术分离纯 化得到了抗血小板溶栓素，进行了生化性质和酶学特性分析：利用分子生物学技术筛选得 到了抗血小板溶栓素的基因，进行了确认和初步表达的尝试，以及对其抗血栓作用机理的 厂 研究。f全文分为四个部分。 第～部分为文献综述，综述了血栓形成机制和蛇毒抗栓组分的最新研究进展，阐明纤 维蛋白原和血小板是二个最主要的独立的血栓形成危险因素。改善高纤维蛋白原水平和抑 制血小板的激活，是现代抗栓药物的主要发展方向。抗栓药物的选择应该把疗效优点和出 血危险性综合考虑。蛇毒中的抗栓组分能作用于阻断血栓形成的不同环节，而最近研究的 血小板膜搪蛋白GP．Ib结合蛋白，由于能特异性阻断血小板性血栓的初期形成，对于血小 板性栓塞具有很好的治疗前景，是继血小板膜糖蛋白GPIIb／IIIa抑制剂之后，最有前途的 新型抗血小板性栓塞的药物。 第二部分重点研究了抗血小板溶栓素的分离纯化、性质鉴定和作用机理。寻找了本品 的分离纯化条件，并考察了本品的生化特性与酶学特性。抗血小板溶栓素是一个分子量为 29kDa,由二个亚基组成的异二聚体双链，等电点为5．5。与其它结构相近的蛋白不同，它 非常特殊地同时具有纤维蛋白原溶解活性和抑制Ristocefin诱导的血小板聚集的活性，抑 制vWF与血小板膜糖蛋白GP．Ib的结合，可以从二方面拮抗血栓形成。为进一步探讨本品 的作用特点，进～步研究了本品在体内对纤维蛋白原，血小板聚集和冠脉血栓形成的影响， 结果表明抗血小板溶栓素对于抗血小板性栓塞具有很好的治疗意义。 第三部分采用筛选蛇JBiO．gtlIcDNA文库的方法，经三轮筛选，PCR鉴定，克隆了抗血 J，并完 lectin 成全序列测定。序列测定和序列同源性分析结果表明抗血小板溶栓素属于蛇毒C．type 家族， 其A、B链与IX／X．结合蛋白A、B链N．端序列的同源性高达85％以上。由于蛇毒 中属于该类蛋白家族成员的蛋白很多，并且其氨基酸序列均具有较高的同源性，本论文进 一步对分离纯化得到的抗血小扳溶栓素进行分子量及质量肽图谱LC／ESI／MS测定，根据图 谱解析的结果分析由cDNA序列推演得到的氨基酸序列的正确性，确证了抗血小板溶栓素 A、B链的序列。 第四部分进行了抗血小板溶栓素的初步表达尝试。将A、B链基因分别克隆入表达载 导下，目的蛋白与谷胱甘肽转移酶的融合蛋白获得了表达，表达量约20％。活性分析结果 B链表达产物具有独立的抗血小板聚集的活性。这一结果对于进一步研究抗血小板溶栓素 的结构和功能，以及对于获得分子量更小、更高效的抗血小板组分．均具有很好的前景。) Abstract on and ofa Thisdissertationfocuses purification，characterization，eDNAcloningexpression and acutus new venom． fibrinogenlyticantiplatelet The that a in clinical resultsindicated is antithrombosisnew the use． Agkisacutacinpotential drug Therewerefour in