人巨细胞病毒部分抗原决定簇基因克隆、表达及初步应用.pdf

硕士擘位论文 人巨细胞病毒部分抗原决定簇基因的克隆、 表达及初步应用 硕士研究生：姜永玮 指导老师：李明教授 摘要 人巨细胞病毒(Human 旋DNA病毒，在世界范围内分布。HCgV不仅是人类先天性病毒感染的主要病原， 而且是免疫功能低下人群(艾滋病患者、器官移植者、免疫抑制治疗者等)并 发感染死亡的常见原因之一。由于HCIHV感染者通常无症状或无特异性症状，建 立HOlY快速、敏感、特异的实验室检测方法并采取早期治疗措施对优生、优育 及阻止HcMV的传播具有重要意义。 HCMV感染的检测方法包括病毒分离培养、核酸测定、抗原检测和血清学检 测等，每种方法各有优缺点。HcMV原发感染的检测，主要采用血清学方法。HC肿 I酬是机体受病毒抗原刺激后最早产生的抗体，是活动性HCMv感染的重要指标 之一，因而是检测HCMV感染的常用指标。 目前国内存在大量检测血清HcMvIgM的试剂盒，多使用从HCMV感染的人 胚肺二倍体细胞中粗提取的完整病毒抗原，各种检测方法对相同血清的检测结 果有很大差别，即是符合率较差。其主要原因为：1．病毒抗原的制备及纯化方 法各不相同；2．提取物中含有多种抗原成分，很难进行标准化；3．制备抗原所 需的HCMV要在人胚肺细胞中培养，此细胞的蛋白可能对制备的抗原产生污染； 4．疱疹病毒有共同抗原，完整的HCMV抗原可以与其它非HcMV病毒感染产生的 抗体发生交叉反应。 由于病毒来源的抗原存在敏感性、特异性、标准化等问题，将通过基因工 程方法获得的表达产物作为检测用抗原已引起各国学者重视。国内外研究工作 中文摘要 者对人巨细胸病毒的一些抗原决定簇进行了免疫原性和特异性研究，期待能够 识别HcMV IgM抗体。 因此，本研究选择HCMV ppUL80a抗原性好、特异性强的部分基因片段作为目的基因，应用基因工程技术， 得到高效表达的目的工程菌，并对表达产物进行了抗原性研究。 此次研究从HCMV感染的细胞上清液中提取HcIlv基因组，本试验用PcR方 法从基因组中扩增获得ppl50a{a595—614(A)、ppl50 aall7—373(E)氨基酸之间的 aa202-434(c)、pp65aa297—510(D)、ppULBOa 多肽片段的编码基因，用重组PCR的方法将前三个片段重组为新的DNA片段(F)， 将D、E、F片段分别克隆至pMD-18T载体测序，核苷酸序列分析证明了PeR扩 增目的序列的J下确性。测序J下确的片段克隆至原核表达载体pGEx一4T-l，构建重 组质粒，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后成功表达了上述三种蛋白，分别命 blotting检测其 免疫特性，结果显示三种蛋白均能被羊抗人巨细胞病毒多克隆抗体及H04VIgM 阳性血清特异性识别，而载体蛋白与多克隆抗体及阳性血清并不能发生反应， 证明这三种蛋白具有良好的抗原特异性，可期待应用于人巨细胞病毒感染的诊 断。经蛋白电泳分析表达产物主要以包涵体的形式存在，根据这三种蛋白不同 的理化特性，采用不同的方法进行蛋白纯化，获得了较好的纯化效果。 时间分辨荧光免疫分析(Time—resolved 世纪八十年代兴起的一种新型非放射性标记技术，TRFIA巧妙利用镧系元素的荧 光特点，克服了普通荧光检测中背景荧光强度大、干扰强的缺点，使强特异性 荧光和背景荧光分辨开，几乎可以完全消除背景荧光的干扰，提高了检测的灵 敏度。与现在广泛使用的放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、化学发光 免疫分析(CLIA)、电化学发光免疫分析(ECLIA)相比，具有灵敏度高、操作 Ⅱ 硕士学位论文 简便、示踪物稳定、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染、 对标记物分子生物活性影响小、多标记等优点，现已成为生物学研究和临床超 微量生化检验中一项颇有发展前景的分析手段。 为分析本实验所表达纯化的三种目的蛋白与HC