人重组白介素13在毕氏酵母中的表达及其体外诱导DC分化作用的研究.pdfVIP

人重组白细胞介素13在毕氏酵母中的表达及 卜门乡。、3 导DC分化作用的研究 研究生:江阳 导师:张学光 摘 要 白细胞介素13是在1993年被命名的一种由活化T2细胞分泌的细 胞因子。其生物学活性与白细胞介素4有许多相似之处，可抑制单核细 胞释放炎症因子;促进B细胞繁殖和转化;抑制H工V-1病毒的复制和肿 瘤的生长，对某些上皮细胞瘤具有高度毒性。临床上工L-13在许多疾病， 特别是在变态反应性疾病，如哮喘的病理发展过程中有重要作用。鉴此， 其在实验和临床应用中的作用倍受关注。 为了获得高效表达人 工L-13的表达菌株，生产具有生物学功能的 IL-13，并研究其在体外诱导DC的作用，我们应用毕氏酵母表达系统表 达人重组工L-13，经分离纯化后，对其生物学活性进行测定，并就其在 体外诱导DC的作用及机制进行研究。 重组人IL-13在毕民醉母中的表达 我们根据文献报道的人 IL-13基因序列，并充分考虑到酵母菌蛋白 质合成时密码子的偏爱性，在不改变工L-13蛋白质序列的前提下，人工 合成6条IL-13基因片段和5条连接片段，经加磷反应、连接反应、PCR 后获得两条大片段，再用TagDNA多聚酶经PCR扩增，形成人工工L-13 的全长片段，将其连接至克隆载体pSK中，测序正确后，再将IL-13基 因片段连接至酵母表达载体夕工CZaA，获得用于酵母表达工L-13的重 组质粒pPICZaA-IL-13。用Sacl酶切重组质粒pPICZaA-IL-13使其 线性化，再电转化至毕氏酵母菌株GS115中，经Zeocine加压筛选后， 获得表达量相对较高且分泌稳定的rh工L-13基因工程菌株。应用全自动 发酵装置进行发酵，表达上清中目的蛋白的表达量达25m酬L。对上清 经透析、超滤浓缩、上柱，分离纯化获得高浓度的IL-13蛋白质 (纯度 95%). alh6ibt A=A1.MAN131L}/1t}pAh 拟**it#DC5?RfkMMVM -一一一~」里 二. 重组人工L-13的生物学活性的测定及其对DC的诱导作用 根据报道我们用氏，，细胞株来检测毕氏酵母表达的人重组工L-13与 标准品IL-13，结果表明我们用毕氏酵母表达的人重组工L-13达到标准 品生物学活性要求，以剂量依赖的方式刺激B9_,，细胞株增殖。工L-13与 工L-4在许多生物学功能上相似，工L-4在体外可诱导外周血单核细胞向 DC转化中有重要作用，因此我们考虑用工L-13来替代工L-4体外诱导DC. 实验发现工L-13也同样有体外诱导外周血单核细胞向DC增殖分化的作 用，表型分析1vII-ICII,CDla、CD80,CD83,CD86等DC指标和混合淋 巴细胞反应刺激T细胞增殖的作用与工L-4诱导得的成熟DC并无显著差 别，未成熟DC的摄取抗原的能力也很强。因此工L-13为体外诱导DC提 供了一条有效途径不 关键词:重组人工L-13;基因工程;毕氏酵母解 ;纯化;Bs-11 细胞株;矜;树突状细胞 州 Expressionofrecombination IL-13inPichia pastorisanditseffectontheinductionofDCfrom PBMC invitro Abstract Postgraduate:JiangYang Tutor :ZhangXueguang Interleukin-13(IL-13)identified in 1993 isapleiotropic cytokinsecretedbyactivatedT2cells.IL-13sharesavariety ofbiologicfunctionswithIL-4,suchasanti-inflammatoryeffects onmonocytesandmacrophages,regulationofB