Pten缺失小鼠胚胎成纤维细胞蛋白质组分析.pdfVIP

Y908936 中文摘要 PTEN缺失的小鼠胚胎成纤维细胞的蛋白质组分析 摘 要 凡a月作为第一个被发现的具有磷酸酶功能的抑癌基冈，在多种肿瘤中存在高频率缺失或突 变。据估讨，总体突变率相当于著名的肿瘤抑制基冈p53，是目前肿瘤研究的热点基因之一。 培育基因敲除小鼠是深入研究基吲功能的最重要手段之一，先后有四家实验室成功培育了 的胚胎成纤维细胞株，是由原代培养的PTEN基闻敲除小鼠的胚胎成纤维细胞永牛化而来，我们 以此为试验模型开展研究。 为了研究PTEN调控细胞各项生命活动的新机制，第一阶段：我们采用蛋白质组学技术来进 行蛋白筛选，首先通过般向电泳技术，比较了PTEN缺失的胚胎成纤维细胞与正常胚胎成纤维细 胞蛋向表达潜，发现在两株不同的PTEN缺失的胚月自成纤维细胞中有明显表达筹异的蛋白，随后 利剐质皤技术鉴定及生物信息学检索分析，找出在厅∞基因敲除小鼠的胚胎成纤维细胞中，抗 PTP、 氧化酶cLl／zflsOD、PeI’oxiredoxinV一Ⅵ，细胞迁移相关蛋白Cofilin1、GDl2，其他如1朋w 1agln2等十多个表达差异蛋白；第二阶段：对筛选出的差异表达蛋白进一步进行分子生物学 技术鉴定，并对部分蛋向进行了相应的生物学活性检测。在此研究中，我们主要采刷MEF2／凡M 细胞系作为试验对象，对MEF【／凡“，7细胞系的蛋白质组学结果只作为参照研究，结果如F： blot及western 1．在，f∞基W敲除小鼠的胚胎成纤维细胞中，Northern blot结果显示： cL-／znsoD在mRNA及萤自质表达水平均高F正常胚胎成纤维细胞，而且酶活性也明显增强；以流 式细胞仪进行荧光探针标记活性氧检测发现：细胞中02含量明显增加。提示尸f舯基因敲除后，细 胞内发生了氧化应激反应，o。的增埘1及AKT信号的增强刺激了cu／zn—sOD的表达。 blot及western 2在凡P口基因敲除小鼠细胞中，通过Norchenl blot检测，结果显示：在 I PRx家族-p，PRxV在mRNA及蛋白质水平均高表达，但只有PRXⅥ低表达。流式细胞仪检测 细胞内H。O。含量明显F降．在给了05mM}l。()2刺激后，细胞内H。0z水平发生，翻转，明显高1i 对照细胞，而lE常对_|}c{细胞巾变化不明显。结果提示在尸f∞敲除细胞中，氧化与抗氧化平衡已 被破坏，细胞内PRX家族在清除1l，O：方面可能发生了重要作用。在戌∞基洲与氧化剂之问、s0D 与『)RxⅥ之问可能存在着负渊控。 3．，)fⅫ基因敲除后，№rLhernbloL及RT—PcR结果显示，细胞中迁移相关蛋白co士ilinl表 达上涧，而GDl2显示下调，符合恶性肿痈的转移表型。 4．其他蛋白：【。MwPTP，Tagln2mRNA低表达，与细胞生长、增殖的信号转导有关。 通过本研究我们发现，尸fM基陶敲除后，细胞内发生了氧化应激反应，原有的氧化与抗氧 化平衡失调，总体抗氧化能力下降，抗氧化酶cu／zn—sOD剌PRx的表达也产生了适应性调警， 氧化剂与P7rEN之间nJ能存在着负调控，并有AKT信号通路的参与。检测山的其它儿种蛋白状 巾文摘蛭 忐硅示：通过刺激细胞内信号转导迎路，对细胞乍K的负调控减弱，增强，迁移能力。这些发 现为进。步深入了解PTEN的功能提供r一』；线索。 硕士学位研究生 于常红(医学遗传学) 硕：l：生导师 王培林教授 李刚研究员 [关键词]：PTEN；活性氧；抗氧化酶；信号转