重组结核分枝杆菌多表位肽的免疫原性研究.DOCVIP

临床医学论文-重组结核分枝杆菌多表位肽的免疫原性研究 ????????????? 作者：娄加陶，周晔，吴传勇，陈燕，蒋天舒，陈波，谷明莉，仲人前，邓安梅? 【摘要】? 目的 探讨纯化的重组结核分枝杆菌多表位肽激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫应答的能力，为新型结核疫苗的设计打下基础。方法 通过细胞增殖和细胞毒性实验，研究纯化的重组表达多表位肽刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性，初步鉴定重组多表位肽的免疫原性。结果 以刺激系数（SI）＞3为界，多表位肽 （10 μmol） 能刺激全部10例HLAA*0201阳性(A2+)结核菌素阳性(PPD+)健康个体的PBMC发生增殖，SI为46.2±5.6；增殖反应明显高于单肽（平均SI为10.2±2.3）以及PPD（平均SI为15.6±3.6）引起的细胞增殖反应(P0.01)。在多表位肽诱导的CTL细胞毒活性分析中以负载抗原肽（10 μmol）的T2细胞作为靶细胞，多表位肽诱导的CTL作为效应细胞，多表位肽能诱导全部的10例A2+ PPD+健康个体中CTL杀伤活性，平均活性分别为(86.2±9.6%)，显著高于单肽\[平均为（25.4±3.6）%\]和PPD\[平均为(22.6±2.8)%\](P0.01)。结论 重组优化多表位肽在细胞水平具有较好的免疫原性，能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性。 【关键词】? 结核分枝杆菌；多表位肽；疫苗 ??? 抗结核病的保护性免疫机制目前仍不清楚，但细胞免疫尤其是循环及感染部位的T细胞应答被认为起着重要作用。CD8+T细胞在抗结核感染中起着重要而独特的作用，尤其是近来AIDS和肺结核的重叠感染频率增加，因此设计以CTL表位为基础，诱导机体产生保护性CTL免疫应答，从而预防和治疗肺结核的疫苗越来越受到重视。但实践证明单纯利用CTL表位制成的肽疫苗或DNA疫苗，特异性CTL免疫应答的水平一般较低，效果都不甚理想。为 　　了获得高效而特异的保护性CTL免疫应答，需要对单纯的CTL表位疫苗进行新的设计和改造。我们设计了含有可引导表位肽进入抗原提呈细胞的“木马肽”序列以及PADRE泛Th表位，并采用了高尔基体内固有肽酶furin识别序列作为表位接头的“串珠式”多表位肽M6[1]。有研究表明，PPD+健康个体作为潜伏性结核分枝杆菌感染者，体内持续存在的抗原引起相应的免疫应答而产生的大量抗原特异性T细胞是机体免疫性保护作用的基础。因此其PBMC对结核分枝杆菌抗原的应答，可作为研究抗结核分枝杆菌保护性免疫的良好模型[2~5]。这样便可以采用PPD+健康个体的PBMC对候选表位或抗原的免疫反应性来验证其免疫原性。本研究探讨纯化的重组结核分枝杆菌多表位肽激发CTL免疫应答的能力，为新型结核疫苗的设计提供良好的方案、奠定良好的基础。 　　1? 材料与方法 　　1.1? 研究对象? 　　10例HLAA*0201阳性健康志愿者，6例HLAA*0201阴性健康志愿者，均为PPD+。留取外周血20 ml，肝素抗凝。 　　1.2? 试剂和试剂盒? 　　LPS、人重组IL2、PPD、人重组GMCSF、人重组IL-4购自RD公司；FITC标记的抗CD3、抗CD8、抗HLA.A2流式单克隆抗体均为Caltag公司产品； HLAA2高分辨SSPPCR试剂盒购自One Lamda公司；时间分辨荧光DELFIA细胞增殖（AD0200）与细胞毒性（AD0016）检测试剂盒均购自Wallac Oy公司；Ag85A(242~250 aa.KLIANNTRV)由上海生工生物工程技术有限公司合成；T2细胞株由上海长征医院临床实验诊断科保存。 　　1.3? HLA分型 　　先以鼠抗人HLAA2单克隆抗体（BB7.2）进行HLAA2流式细胞仪初步筛选，然后再以HLAA2高分辨SSPPCR试剂盒进一步确认其A*0201亚型。 　　1.4? 抗原肽诱导CTL制备? 　　用密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞，种于6孔细胞培养板，在含10%FCS的RPMI1640培养基中，37 ℃ 5%CO2孵育1.5? h。收集悬浮细胞，以10%二甲亚砜90%小牛血清保存于液氮备用。贴壁细胞为抗原提呈细胞－树突状细胞(DC)前体细胞，补充含GMCSF(1 000 U/ml)，IL4(1 000 U/ml)及含10%FCS的RPMI1640培养液，37 ℃ 5%CO2培养7 d 促其转化，需要时补充新鲜培养液。5 d 后，加入LPS(1 mg/L)培养2 d 后促进DC成熟，γ照射使其失去增殖活性。将经过照射的DC分别与抗原肽、多表位肽、PPD(10 μmol/L)在培养液中，37 ℃ 5%CO2共孵过夜。分别