【生物技术】第六讲 植物原生质体培养技术.ppt

原生质体（Protoplast） 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。 植物原生质体培养的意义 在真核生物中将遗传物质由一个个体传给另一个个体的传统方法是有性杂交。但是有时候会存在有性不亲和。 如果通过细胞融合的手段就可以为远缘杂交提供一种可能性。 高等植物原生质体除了可用于细胞融合的研究外，还能通过它们裸露的质膜摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒。 原生质体的这些特性与植物细胞的全能性结合在一起，已经在遗传工程和体细胞遗传学中开辟了一个理论和应用研究的崭新领域。 来源： ① 无菌苗 ② 温室培养的苗 培养条件： 低光照强度（1000lx） 短日照 温度为20～25℃ 相对湿度为60%～80% 以及充足的氮肥供应。 2 前处理 要保证酶解能充分的进行，必须促使酶溶液渗入到叶片细胞间隙中。为此，要做到： 撕去叶片的下表皮，以无表皮的一面向下，使叶片漂浮在酶液中。 或把叶片切成小块，结合真空处理效果更好。 或用金刚砂摩擦叶的下表皮。 3 提取方法 ①机械分离法（Machanical isolation） ②酶法分离（Enzymatic isolation） ①机械法 优点：（1）能排除酶的有害影响；缺点：（1）原生质体的产量低；（2）方法繁琐费力；（3）局限性大 ②酶解法 纤维素酶类（Cellulase） 果胶酶类（Pectolyase） 半纤维素酶类（Hemicellulase） 崩溃酶 蜗牛酶 ①离心沉淀法 原理：原生质体的比重比较大，离心后原生质体沉于底部。 步骤： 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心（500～1000rpm,离心5～6min）。 第三步吸去上清液，沉淀物重新悬浮，再离心沉淀。如此2～3次。 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。 ②漂浮法 原理：利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉到管底。 离心后碎屑沉到管底，一个纯净的原生质体带出现在蔗糖溶液和原生质体悬浮液培养基的界面上。 * 植物原生质体培养技术 一 原生质体的分离 1 材料来源 植物原生质体最方便的来源是叶片，因为叶片中可以分离出大量的比较均一的细胞，而又不致使植物遭到致命的破坏。 由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。 植株的年龄和生长条件是十分重要的。 原生质体分离常用的商品酶 酶 来源 生产厂家 纤维素酶类 onozuka R–10 绿色木霉 Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Cellulysin 绿色木霉 Calbiochem., San Diego, CA 92037, USA Driselase Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japan 果胶酶类 Macerozyme R-10 根霉 Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, Japan Pectinase 黑曲霉 Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USA Pectolyase Y-23 黑曲霉 Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan 半纤维素酶 Rhozyme HP-150 黑曲酶Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA Hemicellulase 黑曲霉 Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO 63178,USA 图示：原生质体分离过程（以叶片为例） 过滤、离心 加果胶酶 和纤维素酶 注意事项： ⑴酶溶剂及其渗透压 酶溶剂：原生质体培养