单克隆培养法分离、鉴定人神经胶质细胞瘤细胞株U251干细胞论文.docVIP

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 单克隆培养法分离、鉴定人神经胶质细胞瘤 细胞株 U251 干细胞 硕士研究生：刘 霄  导  师：林 宁 教授  中文摘要 目的 研究人神经胶质细胞瘤细胞株 U251 中肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定方 法。 方法 将贴壁生长的 U251 细胞用胰酶消化成单细胞悬液，1200rpm/min 离心 5min 后加入含有 EGF、bFGF、N2、B27、L-glu 及青链霉素的 DMEM/F12 培养基重 悬细胞，以大于 105/孔接种到 24 孔培养板中，以后逐日观测肿瘤球生长情况， 待肿瘤球形成并从板底脱落后，将肿瘤球吸出离心反复吹打至单细胞悬液，以每 孔 1-2 个细胞转移至 96 孔板中行单克隆培养，以后动态记录形成次代肿瘤球的 孔，同样方法进行培养三代肿瘤球。添加含血清的培养基行肿瘤球分化前后光镜、 电镜形态以及细胞免疫荧光染色研究。 结果 贴壁生长 U251 细胞在含各种因子及添加剂的无血清培养基中经 7 天左右 可以形成形状较为规则的肿瘤球，单克隆培养三代肿瘤球所需时间明显缩短至约 48 小时。添加含血清培养基后三代肿瘤球可以明显分化，行免疫荧光染色肿瘤 球可以表达 Nestin 干细胞标记物，分化后细胞可表达星型胶质细胞 GFAP、神经 元 β-Tubulin等标记物。单克隆培养形成的肿瘤球细胞分化前后的电镜形态存 在明显差异。 结论 在建系已久的人脑胶质瘤细胞系 U251 中分离肿瘤干细胞可以避免原代培 养肿瘤干细胞中混杂其他细胞的缺陷，单克隆培养出来的肿瘤干细胞形状更为规 则、细胞种类更为单一。单克隆培养法不失为一种简便、有效分离干细胞的方法。 U251 肿瘤球保持了干细胞球的特性，自我更新、多向分化潜能以及分化前后表 达不同的标记物。本实验进一步证实了脑肿瘤细胞系中存在脑肿瘤干细胞亚群， 为脑肿瘤干细胞基础研究建立研究平台，从而进一步为临床治疗脑肿瘤提供理论 依据。 关键词 肿瘤干细胞；脑肿瘤；U251 2 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Isolation and Characterization of Cance Stem Cells from a Human Glioblastoma Cell Line U251 Postgraduate: Liu Xiao  Tutor  : Prof. Lin Ning  Abstract Objective: To study the method of isolation and identification of the cancer stem cells from human glioblastoma cell line U251. Methods: The adherence growing U251 glioblastoma cells were digested into single cell suspension with trypsin. Then re-suspended cells to single cell suspension after 5min centrifugation 1200rpm/min with DMEM/F12 medium containing EGF, bFGF, N2, B27, L-glu, penicillin and streptomycin. The cells were seeded in 24-well plates at more than 105cells/well. Observe the wells every day till some tumor cell spheres could be see fell off the bottom of the plate. The spheres were blew repeatedly to single cells suspension and then were seeded in 96-well plates at 1-2 cell/well. Then mark the wells which formed second generation tumor spheres dynamically. Use the same way to culture the third generation tumor spheres. Then study the morphology of the tumor spheres under light and electron microscope and immunofluorescence staining before