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SSR标记技术 一、简介、原理 二、多态性基础 三、开发、前景 一、SSR标记 原理 简单序列重复(single sequence repeat）简称SSR s)或微卫星(m icrosatellite)序列大量地存在于大多数真核生物及部分原核生物基因组的非编码区和编码区中，由串联的1- 6 个核苷酸重复片段构成，长度一般在100bp以下，具有长度的超变性。 原理:与微卫星序列相邻的两侧区域保守性通常较高，可以在此保守区域设计一对特异的PCR引物，扩增其中的微卫星序列，通过聚内酞胺凝胶电泳，即可显示出个体间在此位点的微卫星序列的多态性。 二、SSR标记 多态性基础 目前研究过的所有植物中均存在着SSR多态性。绝大多数作物，如大豆、水稻、小麦、玉米、大麦等中，SSR位点上的等位基因数目可多达十几个乃至几十个，个别作物多态性水平较低。和其他DNA分子标记相比，单个SSR位点检测到的等位基因个数和多态性指数(diversity index，用1- E可表示，其中P为某一位点第i个等位基因)是最高的。 对人类SSR的研究表明，核心序列的重复次数与SSR的长度多态性有密切关系。重复次数增加，SSR的长度多态性增高。这一趋势也在一些作物中得到证实。不同重复类型SSR多态性水平存在差异，二核苷酸重复构成的SSR多态性水平要高于其他类型。同一类型SSR的不同位之间，其多态性水平也不一样。有些种类SSR位点其多态性水平明显高于其它位点.如在大豆的研究中发现7个 (ATT) n位点等位基因数目可多达11-26个;由AT重复构成的SSR甚至可区分遗传基础极其狭窄的日本梗稻育成品种。 (TAA/ATT) n类型SSR是小麦基因组中最丰富、多态性最高的三核苷酸重复类型SSR。但因(AT)n类型寡聚核苷酸探针容易形成二级结构，降低了筛选效率，影响了这一类型SSR的分离.然而现有研究表明，(AT)n类型SSR仍是可以分离的。 SSR标记的优势 与其他分了标记如:如RAPD ,RFLP等相比，SSR标记具有以下的优点: （1）在植物基因组中大量地、随机地分布，具有广泛的位点变异，揭示比RAPD , RFLP更多的多态性. （2） SSR标记揭示的是单个位点上复等位基因的信息，为共显性标记，能够区分纯合型和杂合型，提供完整的遗传信息. （3）微卫星序列多态性可以用PCR方法检测，不需要过多的分了克隆乎段，对DNA模板的要求不高，重复性好.因此成为在植物中日前运用最广泛的分了标记之一，广泛地运用于植物种质鉴定、分了标记连锁图的构建和群体遗传学等诸多领域. 但是微卫星标记存在一个重要的局限性就是微卫星序列两侧区域在种间保守性往往较低.种间扩增微卫星标记仅仅局限于同一个属或相近的属的不同物种间的扩增，这大大限制了SSR标记在其他物种中的运用现在有一些从微卫星序列衍生而来的其他分了标记，不用分离单个微卫星位点而获得多个位点指纹图谱，如LSSRs、、SAM 等，但由于多位点微卫星指纹图谱带型复杂，难以确定等位基因，大多为显性标记，这限制了它们的运用的范围 三、SSR标记的开发 传统用于克隆单位点微卫星序列的方法包括以下步骤: (1)构建小片段或大片段的基因组. (2)筛选阳性克隆.通过传统的影印或挑单菌落点膜的方法，把克隆转移到尼龙膜上，经过固定后，用标记过的序列重复寡核有酸或含微卫星序列的探针‘与尼龙膜上的克隆点杂交，筛选出其中的阳性克隆. (3)测序、设计引物、优化PCR反应条件.获得的阳性克隆经过确认后，全部或经过随机挑选后测序，然后根据微卫星序列两侧保守区域的序列设计引物，优化PCR扩增的条件，获得稳定、可靠的SSR标记。 微卫星标记分离技术 为了避免筛选文库，现在有一些与其他成熟技术结合的分离微卫星标记的方法，包括: （1）运用RAM P和RA PD技术分离单位点微卫星标记 RAM P 利用5’含有四个锚定碱基的微卫星引物结合不同的RA PD引物在基因组DNA中扩增，获得片段包括两头带反向微卫星序列的扩增片段(为USSR产物)、随机扩增的片段(RA P产物)、随机引物与微卫星基因座间的片段(SSR产物).用标记的5‘锚定引物扩增或经Southern 后在用标记的微卫星探针与之杂交后，再经过自显影，可以得到只含微卫星标记的指纹图谱.在RAM P和RAPD技术的基础上，人们运用RAM P技术和RA PD技术扩增基因组DNA，得到扩增产物，然后用标记的微卫星的探针与PCR产物Southern杂交或用标记微卫星锚定引物，